周東興，李 晶，寧玉翠，金聰敏，王恩澤，李 欣，劉 多

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

近年來，為提高動物的產(chǎn)量、生殖率和免疫力，養(yǎng)殖場廣泛使用含重金屬的飼料添加劑，飼料中重金屬含量超標現(xiàn)象嚴重[1]，然而，這些重金屬元素在畜禽體內(nèi)利用率很低，95%以上會隨畜禽糞尿排泄出來[2]，畜禽糞便長期大量地直接農(nóng)用會導(dǎo)致土壤及植物中重金屬含量增加[3]，處理不當(dāng)很容易對周圍環(huán)境造成嚴重影響[4]。其中以豬糞便中的重金屬Cu、Zn污染最為嚴重[5]，因此，關(guān)于豬糞中重金屬Cu、Zn污染殘留的問題急需解決。重金屬的危害不僅與其含量有關(guān)，更重要的是取決于其賦存形態(tài)[6]，重金屬的形態(tài)直接影響重金屬的毒性、遷移及其在自然界中的循環(huán)[7]，如何處理豬糞中殘留的重金屬成為許多研究者關(guān)心的問題。目前，有研究者認為利用蚯蚓處理豬糞是一種較好的方式，蚯蚓可以促進豬糞中的有機質(zhì)分解，對重金屬元素具有很強的富集作用，具有修復(fù)重金屬污染的潛力[8]。但蚯蚓作用對豬糞中重金屬形態(tài)和酶活性的影響方面研究較少。

此外，重金屬污染程度還可由一些酶的酶活性穩(wěn)定而敏感地反映出來，因此探討用酶活性作為判定重金屬污染程度的生化指標具有重要意義[9]。關(guān)于豬糞中重金屬的研究，前人已做了大量的工作，但大多集中在豬糞中重金屬含量、鈍化、去除及形態(tài)轉(zhuǎn)化等方面，而關(guān)于形態(tài)與酶活性間的關(guān)系，可供參考的研究非常有限。因此，本文以半腐熟豬糞為研究對象，利用蚯蚓處理的方式進行試驗，定期測定試驗過程中豬糞的重金屬含量、形態(tài)及酶活性，研究了蚯蚓處理豬糞過程中重金屬形態(tài)及酶活性的變化，同時探討了酶活性對豬糞中重金屬形態(tài)遷移轉(zhuǎn)化的影響，以期為研究豬糞中重金屬遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及理化性質(zhì)

供試豬糞:半腐熟狀態(tài)豬糞，來源為哈爾濱市周邊養(yǎng)殖戶，去除雜物，過2 mm篩備用，其基本理化性質(zhì)和重金屬含量如表1所示。

供試蚯蚓:取自哈爾濱市雙城區(qū)蚯蚓養(yǎng)殖廠，為赤子愛勝蚓屬，選取具有明顯生殖環(huán)帶的健康成蚓，試驗前，先用清水沖洗干凈蚯蚓體表，并用濾紙擦干水分后將其置于濕潤的濾紙上，避光清腸處理24 h，再次洗凈蚯蚓體表，在豬糞中進行馴養(yǎng)。馴養(yǎng)至少2周后，挑選出大小均勻的蚯蚓進行豬糞處理試驗。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗以泡沫箱作為試驗裝置，分別稱取2 kg（干物質(zhì)量）過2 mm篩的豬糞于泡沫箱中，用去離子水調(diào)節(jié)豬糞濕度為60%左右，根據(jù)試驗設(shè)計每箱放入不同數(shù)量的大小均勻、生長活躍、環(huán)帶明顯的成蚓，并用細紗網(wǎng)覆蓋以防蚯蚓逃逸，置于室溫條件下進行培養(yǎng)。試驗設(shè)4個處理，分別接種3種密度的蚯蚓（基質(zhì)均為2 kg豬糞）:對照處理（豬糞2 kg，不接種蚯蚓，CK）；處理1，蚯蚓處理（蚯蚓/基質(zhì)為1/40，T1）；處理2，蚯蚓處理（蚯蚓/基質(zhì)為1/20，T2）；處理3，蚯蚓處理（蚯蚓/基質(zhì)為1/10，T3）。本試驗蚯蚓處理周期定為2個月，每周定期取樣，取樣后將樣品風(fēng)干后，用于測定酶活性和重金屬形態(tài)。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 酶活性測定

脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定；蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定；磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法測定；脫氫酶活性采用氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法測定[10]。

表1 所用原料基本性質(zhì)Table 1 Chemical properties of the materials

1.3.2 重金屬形態(tài)測定

采用MBCR連續(xù)浸提法[11]進行Cu、Zn形態(tài)的測定，依次得到水溶態(tài)（B1）、弱酸提取態(tài)（B2）、可還原提取態(tài)（B3）、可氧化提取態(tài)（B4）、殘渣態(tài)（B5）5種重金屬形態(tài)，原子吸收分光光度法測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理分析和作圖。IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行相關(guān)性統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚯蚓處理豬糞過程中重金屬的變化特征

由圖1、圖2可知，蚯蚓處理過程中，重金屬Cu的濃度呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，Zn的濃度則先降低后又有所升高，但仍顯著低于初始值。試驗結(jié)束后，蚯蚓處理組的兩種重金屬含量T1（Cu）、T2（Cu）、T3（Cu）和T1（Zn）、T2（Zn）、T3（Zn）分 別 降 低 了 19.66%、24.81%、26.41%和10.82%、14.34%、19.58%，說明蚯蚓處理可以降低豬糞中重金屬含量，且蚯蚓條數(shù)越多，重金屬含量降低的越多。蚯蚓體內(nèi)重金屬含量與豬糞中重金屬含量的比值為富集系數(shù)[12]，因此計算得到本試驗蚯蚓處理結(jié)束后T1、T2和T3各處理重金屬Zn元素的富集系數(shù)分別為0.18、0.22和0.26，Cu元素的富集系數(shù)分別為0.13、0.15和0.20，且各處理的兩種元素的富集系數(shù)均表現(xiàn)為Zn＞Cu。

圖1 重金屬Cu的形態(tài)分布Figure 1 The distribution of speciations of heavy metal Cu

圖2 重金屬Zn的形態(tài)分布Figure 2 The distribution of speciations of heavy metal Zn

動植物對重金屬的吸收量與重金屬的生物有效性緊密相關(guān)。重金屬各種形態(tài)在環(huán)境中的生物可利用性順序為:水溶態(tài)＞弱酸提取態(tài)＞可還原提取態(tài)＞可氧化提取態(tài)＞殘留態(tài)。其中，前3種形態(tài)具有較高生物有效性，屬于不穩(wěn)定形態(tài)，后2種屬于穩(wěn)定形態(tài)。如圖1所示，Cu主要以殘渣態(tài)存在，試驗結(jié)束時，T1、T2和T3處理組殘渣態(tài)所占的百分比分別增長了10.32%、14.06%和14.94%。隨著蚯蚓處理過程的進行，可氧化態(tài)和殘渣態(tài)兩種穩(wěn)定態(tài)重金屬所占的百分比呈先增加后降低并趨于穩(wěn)定，試驗結(jié)束后，T1、T2和T3處理組比CK處理的穩(wěn)定態(tài)重金屬增加了6.67%、8.76%和9.64%。

從圖2中可以看出，整個處理過程中Zn水溶態(tài)未檢出，主要以殘渣態(tài)的形式存在，試驗結(jié)束時T1、T2和T3處理組的殘渣態(tài)所占的百分比分別增長了13.5%、12.80%和13.35%。隨著蚯蚓處理過程的進行，可氧化態(tài)和殘渣態(tài)兩種穩(wěn)定態(tài)重金屬所占的百分比逐漸增加，試驗結(jié)束后，T1、T2和T3處理組比CK處理穩(wěn)定態(tài)重金屬含量增加了14.75%、14.88%和14.34%。

2.2 蚯蚓處理豬糞過程中酶活性變化

2.2.1 蔗糖酶活性的變化

由圖3可以看出，蚯蚓處理過程中，不同時期各處理均表現(xiàn)為T3處理對蔗糖酶活性影響最大。表現(xiàn)為蚯蚓條數(shù)越多蔗糖酶活性越高，蔗糖酶活性的變化趨勢是逐步升高，到第49 d后趨于平穩(wěn)。試驗結(jié)束與初始時相比，T1、T2、T3處理蔗糖酶含量升高，分別升高55.47%、46.87%和34.83%，蚯蚓處理各時期蔗糖酶活性均較CK處理顯著增強，這是由于蚯蚓活動帶來豐富的能源以及微生物，促進堆制物中微生物代謝，進而提高了酶活性。

2.2.2 脲酶活性的變化

處理初期，脲酶活性逐漸升高，在第42 d上升至最大，隨后呈下降趨勢，但下降幅度不大（圖3）。這是由于在蚯蚓處理前期階段，堆制物中微生物數(shù)量及活性的增加，引起脲酶活性升高。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗結(jié)束時，T1、T2、T3處理中脲酶活性分別降低了42.02%、26.73%和10.08%，蚯蚓處理后脲酶活性降低，脲酶活性對尿素的轉(zhuǎn)化作用具有很大的影響，其活性的降低可以促進氮素的緩釋作用。

2.2.3 脫氫酶活性的變化

脫氫酶活性在蚯蚓處理初期呈顯著上升趨勢，其中第28 d達到峰值，而后呈降低趨勢（圖3），這可能與蚯蚓處理的底物濃度變化有關(guān)。此外，相同處理時間下，各處理酶活性顯著高于CK處理，且T3處理脫氫酶活性最高，說明T3處理可能具有相對較高的微生物活性。試驗結(jié)束時，各處理脫氫酶活性與試驗初期相比，T1、T2、T3處理脫氫酶活性分別升高了32.79%、58.97%、53.87%，脫氫酶活性在處理初期不斷升高，反映了蚯蚓處理過程的氧化反應(yīng)主要在初期進行。蚯蚓處理的脫氫酶活性在整個處理過程中高于CK處理，說明加蚯蚓處理對堆制物的分解具有促進作用。

2.2.4 堿性磷酸酶活性的變化

由圖3可以看出，各處理對堆體中堿性磷酸酶活性的影響差異顯著。在蚯蚓處理初期（7～21 d），各處理組堿性磷酸酶活性均升高，且在第21 d出現(xiàn)第一個小高峰；后在蚯蚓處理的第49 d各處理酶活性均達到最高。從整個處理過程來看，堿性磷酸酶活性在不同時期的變化波動較大。試驗結(jié)束時，T1、T2、T3處理的堿性磷酸酶活性較試驗開始時升高了116.38%、100.48%和94.65%，說明蚯蚓處理能夠顯著提高堿性磷酸酶活性。在蚯蚓處理過程中各時期各處理的堿性磷酸酶活性均較CK處理顯著增強，這可能是蚯蚓生命活動產(chǎn)生的分泌物與微生物協(xié)同作用導(dǎo)致的。

2.3 重金屬形態(tài)與酶活性的相關(guān)性分析

圖3 蚯蚓處理對堆體中酶活性的影響Figure 3 Effects of the enzymatic activities during vermicomposting

重金屬與土壤中脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、脫氫酶等酶活性緊密相關(guān)。為此，本文在研究過程中選擇堆制物中脫氫酶、脲酶、磷酸酶和蔗糖酶作為其中關(guān)鍵酶的代表進行研究。堆體中Cu和Zn各形態(tài)含量與堆體中酶活性的相關(guān)性如表2所示，對于重金屬Cu，其水溶態(tài)與脲酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶活性呈顯著負相關(guān)，弱酸提取態(tài)與脫氫酶和堿性磷酸酶活性呈顯著負相關(guān)，可還原提取態(tài)與脲酶、堿性磷酸酶活性呈顯著負相關(guān)，可氧化提取態(tài)與蔗糖酶活性呈極顯著負相關(guān)，該形態(tài)還與堿性磷酸酶活性呈顯著負相關(guān)，殘渣態(tài)與蔗糖酶活性呈極顯著負相關(guān)。對于重金屬Zn，弱酸提取態(tài)與蔗糖酶活性呈極顯著負相關(guān)，其可還原提取態(tài)與蔗糖酶活性呈極顯著負相關(guān)，可氧化提取態(tài)與脲酶活性呈極顯著負相關(guān)，該形態(tài)還與堿性磷酸酶和脫氫酶活性呈顯著負相關(guān)，殘渣態(tài)與蔗糖酶活性呈顯著負相關(guān)。

Cu元素與堿性磷酸酶和蔗糖酶活性呈顯著負相關(guān)，Zn元素與4種酶活性均呈負相關(guān)，但由相關(guān)性系數(shù)計算可以看出，這兩種元素的各個形態(tài)對酶活性的相關(guān)性大多明顯高于總量與酶活性的相關(guān)性。

3 討論

3.1 蚯蚓處理對重金屬含量及形態(tài)變化的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，各處理組重金屬含量與CK處理相比均有不同程度降低，且表現(xiàn)為蚯蚓條數(shù)越多，重金屬含量降低越多，表明蚯蚓處理能夠顯著降低重金屬含量[13-14]。然而，CK處理Cu、Zn兩種重金屬元素的含量均表現(xiàn)為略有升高，主要是由于堆置物料中易揮發(fā)成分的濃縮作用[15]導(dǎo)致的。重金屬含量下降有兩方面原因，一方面，蚯蚓處理豬糞過程是有機物料在微生物作用下完成的，是一個復(fù)雜的發(fā)酵過程，有機物經(jīng)蚯蚓與微生物共同作用分解并腐殖化[16]，同時蚯蚓的分泌產(chǎn)物會影響和調(diào)控它周圍堆體中的微生物的數(shù)量活性[17]以及堆體的pH值，從而活化堆體中的重金屬[18]，降低堆體中的重金屬含量。另一方面，蚯蚓在處理豬糞過程中積累了大量的重金屬，使豬糞中重金屬的含量降低，許多研究均表明蚯蚓能富集重金屬[19-21]；本試驗蚯蚓處理結(jié)束后Cu、Zn兩種元素的富集系數(shù)表現(xiàn)為Zn＞Cu。大量的試驗研究表明蚯蚓對豬糞中這兩種重金屬元素的吸收富集能力均表現(xiàn)為Zn＞Cu[22-26]，與本研究結(jié)果一致。

此外，在本研究中各處理的Cu、Zn兩種元素穩(wěn)定形態(tài)所占比例增加，表明蚯蚓處理能夠降低其生物有效性。蚯蚓處理過程中促進了腐殖質(zhì)的形成，引起殘渣態(tài)Cu元素的變化，從而導(dǎo)致其穩(wěn)定態(tài)所占比例增加，有助于不穩(wěn)定態(tài)重金屬向穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)化[27]。綜上表明蚯蚓處理有利于Cu元素趨于穩(wěn)定，且添加蚯蚓條數(shù)越多，Cu元素穩(wěn)定態(tài)含量越高。Zn元素穩(wěn)定態(tài)比例增加主要是由水溶態(tài)的變化引起的，這部分重金屬吸附于黏粒礦物或腐殖質(zhì)等活性組分上，易于轉(zhuǎn)化，對pH值變化敏感，pH低時易于釋放到環(huán)境中[28]，本研究在蚯蚓處理過程中pH由開始的7.56下降到6.14，促進了水溶態(tài)Zn的釋放，降低了不穩(wěn)定態(tài)Zn的含量，促使Zn元素向穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)化。

3.2 蚯蚓處理過程中對堆制物酶活性的影響

本研究的堆制物中蔗糖酶活性隨蚯蚓處理進程呈現(xiàn)出先升高后趨于平穩(wěn)，脲酶和脫氫酶活性則表現(xiàn)為先升高后降低，與大多學(xué)者研究結(jié)果一致[29-31]。這是由于處理初期蚯蚓的活動改善了堆體的內(nèi)部環(huán)境，提高了微生物活性，促進堆體中物料的分解，從而使各處理酶活性升高，而在處理后期各處理的酶活性呈降低趨勢，可能是與蚯蚓處理過程中底物濃度的變化有關(guān)[32]。各處理不同時期堿性磷酸酶活性變化較大，最終表現(xiàn)為堿性磷酸酶活性顯著升高。本研究得到的結(jié)果與他人研究具有一定差異性[33]，產(chǎn)生差異的原因可能由于蚯蚓投放密度、溫度等的不同進而影響蚯蚓及微生物生存環(huán)境，導(dǎo)致微生物量和活性降低，從而影響了酶的活性。

表2 重金屬形態(tài)與酶活性之間的線性相關(guān)系數(shù)Table 2 Relationship between heavy metals speciations and enzymes activities

在蚯蚓處理過程中相同處理時間條件下，各處理組的酶活性均顯著高于CK處理，說明蚯蚓處理可以有效提高堆制物中各種酶活性，這是因為蚯蚓通過攝食、消化、排泄有機顆粒物產(chǎn)生大量蚓糞等代謝產(chǎn)物，從而影響微生物群落的數(shù)量、組成與活性[34-36]，進而提高酶活性。此外，蚯蚓生命活動能夠直接作用于底物，而且能夠與微生物存在共生關(guān)系，隨著蚯蚓條數(shù)的增加，蚯蚓的直接作用以及與微生物的協(xié)同作用都得以加強[37]，致使各處理酶活性顯著高于CK處理。

3.3 蚯蚓處理過程中重金屬形態(tài)與酶活性的相關(guān)性

蚯蚓堆制過程中重金屬不同賦存形態(tài)與酶活性存在一定的相關(guān)性。通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，蚯蚓處理豬糞過程中重金屬Cu和Zn不同賦存形態(tài)與酶活性存在以下相關(guān)性:脲酶活性與Cu的水溶態(tài)、可還原提取態(tài)顯著相關(guān)，其中水溶態(tài)Cu對脲酶活性的抑制作用貢獻最大，同時，可氧化提取態(tài)Zn對脲酶活性的抑制作用貢獻最大。堿性磷酸酶活性與Cu的水溶態(tài)、弱酸提取態(tài)、可還原提取態(tài)、可氧化提取態(tài)顯著相關(guān)，但可還原提取態(tài)Cu對堿性磷酸酶活性的抑制作用貢獻最大；同時可氧化提取態(tài)Zn對堿性磷酸酶活性的抑制作用貢獻最大。蔗糖酶活性與Cu的水溶態(tài)、可氧化提取態(tài)和殘渣態(tài)顯著相關(guān)，其中殘渣態(tài)Cu對蔗糖酶活性的抑制作用貢獻最大；蔗糖酶活性還與Zn的弱酸提取態(tài)、可還原提取態(tài)和殘渣態(tài)顯著相關(guān)，其中可還原提取態(tài)Zn對蔗糖酶活性抑制作用貢獻最大。脫氫酶活性與Cu的弱酸提取態(tài)和Zn的可氧化提取態(tài)顯著相關(guān)，且這兩種形態(tài)對脫氫酶活性抑制作用貢獻最大。本研究得到的結(jié)果與李玉等[28]的研究不同，引起差異的原因可能是研究基質(zhì)不同且本文采用蚯蚓堆置方式來處理基質(zhì)，這些都會影響各種酶活性與重金屬形態(tài)的相關(guān)性。表2中蔗糖酶與可氧化提取態(tài)和殘渣態(tài)Cu達到極顯著負相關(guān)，說明蔗糖酶對Cu較敏感；脲酶與可氧化提取態(tài)Zn呈極顯著負相關(guān)，蔗糖酶與弱酸提取態(tài)Zn和可還原提取態(tài)Zn達到極顯著負相關(guān)，說明脲酶和蔗糖酶對Zn較敏感。本研究初步表明，這些酶活性的大小能夠反映豬糞中重金屬Cu和Zn污染程度，此結(jié)果尚需進一步驗證。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)Cu和Zn的各形態(tài)對酶活性的相關(guān)性程度大多明顯高于其總量與酶活性的相關(guān)性，說明用重金屬形態(tài)來研究重金屬與酶活性的關(guān)系比重金屬總量指標更為準確，這與劉霞等[38]的研究結(jié)果一致。綜上研究表明，一方面重金屬各形態(tài)濃度的變化會激活或抑制酶活性，另一方面蚯蚓在堆制豬糞過程中酶活性的變化也可以用來指示豬糞中重金屬含量和形態(tài)轉(zhuǎn)化狀況[39]。

4 結(jié)論

（1）蚯蚓處理結(jié)束時，堆制物中Cu、Zn兩種重金屬元素的含量均下降，形態(tài)隨著蚯蚓處理向穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)化，主要以殘渣態(tài)含量較高，蚯蚓處理能夠降低重金屬元素的生物有效性。

（2）蚯蚓處理能夠提高脲酶、蔗糖酶、脫氫酶和堿性磷酸酶活性，且隨著蚯蚓處理時間的延長脲酶、脫氫酶、蔗糖酶均呈先升高后降低趨勢，其中堿性磷酸酶的變化趨勢不明顯。

（3）堆制物中Cu、Zn的各化學(xué)形態(tài)與酶活性的關(guān)系為可還原提取態(tài)和可氧化提取態(tài)對堆制物酶活性的抑制作用最大，殘渣態(tài)和弱酸提取態(tài)對堆制物酶活性的有一定的抑制作用，水溶態(tài)對堆制物酶活性影響程度較小。