王效瑾，高 巍，趙 鵬，于沖沖，劉紅恩，聶兆君，秦世玉，李 暢

（河南農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，河南省土壤污染防控與修復重點實驗室，鄭州 450002）

鎘（Cadmium，Cd）作為人體非必需元素，是毒性最強的重金屬元素之一。當土壤受到Cd污染后，Cd會在生物體內富集，并通過食物鏈進入人體從而引起慢性中毒[1]。因此，目前Cd引起的環(huán)境污染問題已經受到了廣大學者的普遍關注[2]。

Cd在土壤-植物-人中的遷移是目前環(huán)境Cd污染及人類健康風險研究的重點和熱點問題之一，植物對Cd的吸收與轉運則是解決問題的基礎和關鍵環(huán)節(jié)。目前已有研究表明，植物對Cd的吸收、轉運和分布積累是一個動態(tài)的過程，包括根系的活化和吸收、木質部的裝載和運輸以及韌皮部裝載和向籽粒中的進一步轉運[3]。目前國內外有關Cd對植物影響的研究多數(shù)集中在研究Cd對植物地上部分的影響方面，如抑制蒸騰作用，使葉片失綠，損壞光合系統(tǒng)，最終導致光合效率下降，影響作物的產量與品質等[4-5]。而根系是植物的主要吸收器官[6]，其形態(tài)、生長和空間分布直接決定著植物對重金屬的吸收能力和吸收效率。研究表明，過量的Cd積累會抑制根系生長，從而降低Cd的吸收能力。因此，研究根系對重金屬脅迫的響應對于揭示植物抵抗重金屬脅迫的機理具有重要意義。而小麥是我國主要的糧食作物，也是世界上覆蓋最廣的糧食作物，研究Cd在小麥體內吸收和運轉機制，對于保障食品安全、實現(xiàn)糧食作物可持續(xù)生產具有重要的現(xiàn)實意義。因此，本文研究了在不同濃度的Cd脅迫下小麥幼苗根系形態(tài)的變化和Cd吸收動力學，以期了解Cd在小麥體內吸收和轉運的過程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種為河南省廣泛種植的百農207。

1.2 試驗設計

本試驗于2017年12月在河南農業(yè)大學資源與環(huán)境學院樓光照培養(yǎng)室進行。試驗選擇大小一致、圓潤飽滿的小麥種子，用自來水沖洗數(shù)次后，用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗3次，之后再用去離子水浸泡12 h，將吸脹后的種子擺放于塑料盆中的尼龍網上，每盆約300粒，置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)（溫度25℃±1℃，濕度75%±1%，光照時間12 h），待小麥幼苗長至一葉一心時，選擇長勢一致的幼苗移入2 L含有2.0 mmol· L-1Ca（NO3）2· 4H2O，3.0 mmol· L-1KNO3，0.5 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O，1.0 mmol·L-1MgSO4·7H2O，50 μmol·L-1EDTA-Fe，23 μmol·L-1H3BO3，4.5 μmol·L-1MnCl2·4H2O，0.15 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.4 μmol·L-1ZnSO4·7H2O 和 0.045 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O 的營養(yǎng)液的塑料盆中培養(yǎng)。第一周使用半強度的營養(yǎng)液，之后用全強度的營養(yǎng)液培養(yǎng)。待小麥幼苗長至2葉1心時（移苗后一周左右），添加不同的Cd處理。

本試驗Cd2+處理濃度為0.5、5、50、200 μmol·L-1，Cd源為CdCl2·2.5H2O，以Cd2+處理濃度0 μmol·L-1為對照。每個處理重復3次，每3 d更換1次營養(yǎng)液。

1.3 測定方法

1.3.1 生長指標的測定

在Cd處理0、3、6、11、17、23 d，分別收獲植株，將根系和地上部分分開，用刻度尺（最小分度單位為mm）測定株高和根長。用刻度尺測量根頸部至幼苗頂端葉尖，即為株高；測量根尖到幼苗莖基部的長度，即為根長[7]。

1.3.2 根系形態(tài)的測定

在Cd處理后第3、6、11、17、23 d后，分別收獲植株，將根系和地上部分分開，根系用EPSON全自動掃描儀掃描記錄小麥的根系形態(tài)并獲取根系圖像，然后采用WinRHIZO 2009根系掃描分析系統(tǒng)（加拿大）分析得出小麥幼苗的總根長、根總表面積、根體積、平均直徑和根尖數(shù)等。

1.3.3 根系橫切面解剖結構的觀察

在Cd處理后第17 d時，取距根尖10 cm處的2 cm長度的主根，置于裝有FAA固定液（40%甲醛∶冰乙酸∶70%酒精=1∶1∶18）的2 mL離心管中固定過夜，之后用OCT包埋劑包埋24 h，然后在-20℃的環(huán)境下利用冷凍切片機對根尖進行橫向切片，切片厚度為35μm，切片后將其附在載玻片上，放在玻片盒中。在-20℃的條件下冷凍干燥3 d，樣品凍干后，用熒光顯微鏡對根尖切片進行觀察。

1.3.4 干質量、Cd含量的測定

在Cd處理后第0、3、6、11、17、23 d每盆取3株樣品，將其地上部分和根分開，根系用20 mmol·L-1Na2-EDTA浸泡15 min，以除去表面吸附的Cd2+[8]，然后用去離子水漂洗、瀝干后，和地上部分放在烘箱中105℃殺青30 min，70℃下烘干至恒質量，然后稱量，記錄地上部分和根系的干質量（DW），并進行Cd含量的測定。

干質量的測定:將根系和地上部洗凈擦干后分別裝入紙袋中，用烘箱烘干至恒質量，在萬分之一的電子天平上測定干質量。

Cd含量測定:參照Zhao等[9]的方法。稱取適量干樣，用硝酸-高氯酸混合酸（體積比為4∶1）消煮完全，用體積分數(shù)為0.5%的HNO3定容到25 mL容量瓶中，用火焰原子吸收分光光度計（ZEEnit 700；Analytik Jena AG，德國）測定Cd含量。

Cd在植物體內由根系向地上部分轉運的轉運系數(shù)（TF）、富集系數(shù)（BCF）及根冠比按下列公式計算:

富集系數(shù)=植株Cd含量（mg·kg-1）/溶液中Cd含量（mg·kg-1）

轉運系數(shù)=植株地上部Cd含量（mg·kg-1）/植株地下部Cd含量（mg·kg-1）

根冠比=根部干質量/地上部干質量

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，利用DPS進行方差分析（ANOVA），使用Sigmaplot 10.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 Cd處理對小麥幼苗生長指標的影響

株高、根長、干物質質量等指標是衡量小麥幼苗生長的重要指標。為了解不同Cd濃度處理對小麥幼苗生長的影響，在試驗中測定了小麥幼苗的株高、根長和干物質量（圖1）。

圖1 Cd處理對小麥幼苗生長指標的影響Figure 1 Effect of Cd treatment on growth index of wheat seedling

由圖1可以看出，在低濃度（0.5 μmol·L-1和5μmol·L-1）Cd處理條件下，與0 d時相比，小麥幼苗在6 d時的根長增加了59.48%和51.22%，與6 d時相比，23 d的根長增加了136.43%和138%。低濃度Cd處理下，小麥幼苗的根長在0～6 d時的增加速率低于6～23 d。在高濃度（50 μmol·L-1和200 μmol·L-1）Cd處理下，小麥幼苗根長的增加幅度則與低濃度Cd處理下的增加幅度相反，6～23 d的根長增加幅度（16.46%和2.41%）低于0～6 d（23.7%和13.44%）。各個Cd濃度處理下株高的趨勢與根長的相似。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因為高濃度的Cd處理使小麥幼苗的株高和根長的生長受到嚴重的抑制作用。在Cd50水平下，小麥幼苗的根冠比較低，且隨著時間的增加呈下降趨勢，說明此條件下小麥幼苗的根系生長受到的毒害比地上部嚴重。

在試驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)在受到高濃度（50、200μmol·L-1）Cd處理11 d后，小麥幼苗根系發(fā)黑，下部葉片的葉梢開始發(fā)黃干枯，生長比較遲緩。幼苗在第11 d開始出現(xiàn)表型差異，表明Cd對植物的危害是一個緩慢的過程，短時間內受到的毒害作用不明顯，隨著處理時間的增加，毒害作用不斷累積增強。在Cd處理后第23 d時，小麥幼苗根系及地上部分生物量均為:Cd0＞Cd0.5≈Cd5＞Cd50＞Cd200。

2.2 Cd處理對小麥幼苗吸收和轉運的影響

圖2 Cd處理對小麥整株Cd積累量、Cd含量、轉運系數(shù)和富集系數(shù)的影響Figure 2 Effects of cadmium treatment on cadmium accumulation，cadmium content，transport coefficient and enrichment coefficient of wheat

小麥幼苗的整株Cd積累量是幼苗的整株干質量與其整株Cd含量的乘積。由圖2可以看出，隨著Cd處理時間的增加，小麥幼苗整株的Cd積累量是逐漸增加的。Cd濃度為0～0.5 μmol·L-1時，小麥幼苗地上部和根部的Cd含量在第6 d時達到峰值。第6 d后，雖然小麥幼苗整株Cd積累量是增加的，但其地上部和根部Cd含量均下降，可能是由于小麥幼苗生物量的增長速度大于體內Cd積累的速度，構成生物稀釋效應。小麥幼苗在50 μmol·L-1和 200 μmol·L-1Cd處理11～23 d時，地上部和根部的Cd含量顯著高于0.5 μmol·L-1和5 μmol·L-1Cd處理（P＜0.05）。且在相同Cd水平下，小麥幼苗根部的Cd含量是遠高于地上部的，大約為2～17倍。

轉運系數(shù)是反映植物不同部位間重金屬遷移能力大小的指標。Cd處理濃度為0.5 μmol·L-1時，Cd在小麥中的轉移系數(shù)為0.16～0.25，顯著高于其他處理。在Cd處理后11～23 d，Cd在小麥幼苗中的轉移系數(shù)為Cd0.5＞Cd5≈Cd50≈Cd200，表明 Cd處理會抑制 Cd從根系向地上部分的轉移，這可能與小麥幼苗的生長在Cd處理下受到抑制，以致減少了隨蒸騰流向地上部轉運Cd2+的量有關。

圖3 Cd處理對小麥幼苗根系形態(tài)參數(shù)的影響Figure 3 Effect of Cd treatment on root morphological parameters of wheat seedling

富集系數(shù)表示重金屬向植物體內遷移的難易程度，是表征植物對重金屬吸收能力的一項重要評價指標。從圖2可以看出，不同Cd濃度下，Cd在小麥幼苗中的富集系數(shù)為Cd0.5＞Cd5＞Cd50＞Cd200，表明小麥對Cd的吸收能力與Cd處理濃度成反比關系。Cd濃度為0.5μmol·L-1時，小麥幼苗富集系數(shù)為0.63～1.53，在第6 d達到吸收最大值。在所有Cd處理中，小麥在Cd0.5時吸收和轉運Cd的能力是最強的。與Cd0.5處理相比，Cd5、Cd50和Cd200處理后吸收能力分別下降了69.56%、92.21%和97.30%，轉移能力分別下降了30.18%、24.68%和30.98%。

2.3 Cd處理對小麥幼苗根系形態(tài)參數(shù)的影響

根系直接與土壤接觸，是植物與土壤環(huán)境接觸的重要界面，土壤中Cd對植物的危害首先會表現(xiàn)在根系的變化上。根生長的好壞，直接制約著地上部分的生長和產量的高低。根長是描述根系吸收水分和養(yǎng)分能力的重要參數(shù)之一。根體積大小是反映根系生長發(fā)育狀況的重要指標。根系直徑是根系與環(huán)境介質直接接觸的重要指標。小麥幼苗在重金屬Cd處理下的根系形態(tài)的變化與超積累植物相比有所不同。

圖3結果顯示，在各個Cd濃度的處理下小麥幼苗的總根長、根體積和總根尖數(shù)在測定的時間段內基本都低于空白組，且在Cd處理后11～23 d，與對照相比，在Cd濃度為5～200 μmol·L-1時，幼苗的總根長和總根尖數(shù)降低顯著（P＜0.05），分別降低了46.51%～82.69%和48.52%～93.71%。這說明Cd處理會對小麥幼苗根系的吸收能力產生抑制作用。在Cd處理11 d后，小麥幼苗的根體積隨著Cd濃度的增加降低了11.72%～73.74%，說明小麥幼苗的根系生長受到了嚴重的毒害作用。隨著Cd處理時間的增加，各個Cd處理濃度下的小麥幼苗根系的平均直徑總體上是增加的，這可能是小麥根系對Cd處理的響應。

2.4 根系形態(tài)參數(shù)與小麥幼苗Cd吸收和轉運能力的相關性分析

為了研究小麥幼苗根系形態(tài)對Cd吸收、轉運的影響，本文對測定的小麥幼苗的根系形態(tài)參數(shù)與轉運系數(shù)、富集系數(shù)進行了相關性分析，見表1。

由表1可知，小麥幼苗的根系形態(tài)參數(shù)中，僅根平均直徑與轉運系數(shù)、富集系數(shù)都具有相關性，且相關性較強。小麥幼苗對Cd的吸收能力（即富集系數(shù)）與根平均直徑呈顯著正相關，且小麥幼苗中Cd向地上部的轉移能力與根平均直徑呈顯著負相關，這說明在根系參數(shù)中，根直徑對小麥Cd的吸收及轉運都起著非常重要的作用。

2.5 Cd處理對小麥幼苗根系的熒光觀察

根系掃描圖片（圖4A至圖4C）顯示小麥幼苗在5、50μmol·L-1Cd處理17 d后根系形態(tài)與空白對照相比發(fā)生顯著變化。為了進一步研究根系是如何應對Cd處理的響應，進行了小麥根系橫切面的熒光顯微鏡觀察，如圖4D至圖4F所示。木質素具有自發(fā)熒光，在紫外光激發(fā)后可發(fā)射出較強的熒光信號。從圖4D至圖4F可以看出，相較于空白對照，Cd處理后可以誘導根直徑明顯增粗。5μmol·L-1Cd處理后，皮層細胞層數(shù)增多、細胞增大；內皮層細胞數(shù)量、大小無明顯變化，但是熒光信號顯著加強；50μmol·L-1Cd處理后，中皮層和內皮層的細胞數(shù)量有明顯增多，熒光信號明顯增強。熒光信號的增強，說明Cd誘導木質素沉淀。

圖4 不同Cd處理下小麥根系切片熒光顯微鏡照片（×200倍）Figure 4 Fluorescence microscopy of wheat root sections under different cadmium treatments（×200 times）

表1 根系形態(tài)參數(shù)與小麥Cd轉運系數(shù)和富集系數(shù)的相關性Table 1 Correlation between root morphological parameters and Cd transport coefficient and enrichment coefficient of wheat

3 討論

3.1 Cd處理對小麥幼苗生長指標的影響

Cd污染是植物生長過程遭受逆境脅迫中最普遍的重金屬污染之一。Cd離子在土壤中的高度移動性致使其容易進入植物體內，累積到一定程度，會擾亂植物新陳代謝過程，從而對植物產生毒害[10]。其中生物量的變化程度可以反映出植物對Cd的耐性情況[11]，在本研究中，與對照（CK）相比，不同濃度Cd處理中小麥幼苗生長受到了不同程度的影響。本試驗結果表明，在同一Cd處理時間下，施用低濃度（0.5、5μmol·L-1）Cd對根和地上部生物量以及株高和根長各項生長指標的影響不顯著，說明在低濃度Cd處理時，小麥幼苗對其有一定程度的耐性。而在高濃度（50、200 μmol·L-1）Cd處理時，隨著Cd濃度的增加，根和地上部生物量以及株高和根長均顯著降低（P＜0.05）。并且隨著處理時間延長，抑制程度加重。說明在高Cd濃度處理下，小麥幼苗受Cd毒害嚴重，生長緩慢。高濃度Cd處理抑制了小麥的生長，而由于植物組織的生長抑制和生物量的下降是細胞死亡的必然結果，因而揭示了Cd對小麥生長和生物量的抑制作用可能和其導致了細胞死亡有關[12]。

3.2 Cd處理對小麥幼苗根系形態(tài)的影響

根系是植物體進行吸收和代謝的主要器官，在響應環(huán)境變化方面表現(xiàn)出高度的發(fā)育可塑性[13]，植物根系形態(tài)可塑性是其在特定環(huán)境下生存策略的重要表現(xiàn)[14]。重金屬脅迫嚴重影響著植物根系的發(fā)育[15]，而根系形態(tài)和結構的變化反過來會影響根系對Cd吸收和木質部的裝載效率，從而影響Cd在植物體內的轉運和積累[16-18]。

本試驗研究結果表明，高濃度Cd處理下，小麥幼苗的根長、根體積和總根尖數(shù)是降低的，但是根系的平均直徑是逐漸增加的。這些數(shù)據(jù)與Ostonen等[19]的論點基本一致，其研究表明Cd脅迫下花生的根長、根表面積、根體積和總根尖數(shù)下降，根系平均直徑增加。Cd處理誘導小麥幼苗根尖數(shù)量減少，表明側根的形成可能被Cd抑制[20]，這也是植物對重金屬脅迫的重要響應。植物的根尖是吸收的重要部位[21]，因此在Cd處理條件下根尖的數(shù)量減少意味著小麥幼苗吸收養(yǎng)分的能力下降。Cd處理導致的根表面積減少，也會使小麥根系吸收養(yǎng)分能力減弱，從而對其生長造成影響[22]。

本試驗相關性分析結果表明，根直徑對小麥Cd的吸收及轉運都起著非常重要的作用，且根系平均直徑與Cd濃度成正比關系。Cd在小麥體內的運輸依次經過表皮、皮層，穿過內皮層到達維管組織，小麥的“馬蹄形”加厚結構可有效阻止Cd的質外體運輸，并使得Cd在穿過加厚結構后，共質體途徑成為其主要運輸途徑[23]。目前有研究表明，植物可以將Cd吸持到非活性部位以降低Cd的毒害，通過細胞壁的固持阻擋Cd進一步進入細胞內[24]。本試驗根系橫切面熒光顯微鏡觀察結果顯示，5μmol·L-1Cd處理可誘導皮層細胞層數(shù)增多、薄壁細胞增大，從而使得皮層細胞可容納更多Cd，減緩Cd的向內運輸；50μmol·L-1Cd處理可誘導皮層和內皮層薄壁細胞數(shù)量明顯增多，厚壁細胞壁木質素進一步沉積，熒光信號增強[25]。木質素的沉淀可提高細胞壁結合重金屬離子的能力，避免其過多地進入原生質體，危害細胞的生長發(fā)育[26]。

4 結論

重金屬Cd對小麥幼苗生長狀況、根系形態(tài)和吸收、轉運Cd存在較為明顯的劑量效應。施用低濃度Cd對小麥幼苗的根和地上部生物量以及株高和根長各項生長指標的影響不顯著。本試驗中在Cd濃度為0.5μmol·L-1時，小麥幼苗的富集系數(shù)和轉運系數(shù)均為最大，說明此濃度下小麥幼苗對Cd的吸收和轉運能力是最強的。高濃度的Cd處理下，小麥幼苗的根長、根體積和總根尖數(shù)逐漸降低，而根系平均直徑逐漸增加，說明根平均直徑的增加可能是小麥根系對Cd處理的響應。且相關性分析結果表明:Cd處理后根系平均直徑的增粗對小麥Cd的吸收及轉運都起著非常重要的作用。