樸瑩 杜蓉 喻涵之

[摘要]目的 比較用小鼠腹部皮下瘤與耳部皮下瘤進行激光共聚焦顯微鏡原位觀察藥物瘤內(nèi)微觀行為方法的可行性與適用性，為研究原位觀察腫瘤內(nèi)藥物滲透提供更好的方法。方法 體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（GFP）的小鼠乳腺癌細胞4T1（4T1-GFP）。將4T1-GFP細胞以皮下注射的方式分別接種到6～8周齡SPF級雌性ICR小鼠的腹部皮下靜脈旁或耳部靜脈旁。待腫瘤長到4～7 mm3大小即對小鼠實施手術(shù)，將腫瘤粘貼于載玻片上。通過尾靜脈將帶有Cy5熒光標記的腫瘤納米藥物注射到小鼠體內(nèi)，用激光共聚焦顯微鏡對腫瘤藥物滲透過程進行程序性圖像采集。結(jié)果 耳部腫瘤細胞最適接種濃度在（2～3）×104/μl ，從第2天開始可用于成像；腹部腫瘤細胞適宜的接種濃度在（1～2）×104/μl，從第3天開始可用于成像。呈圓盤狀包繞血管生長、血管分支較少的腫瘤更有利于進行腫瘤藥物血管滲透成像。耳部和腹部皮下瘤模型均可較好呈現(xiàn)藥物的滲透過程。結(jié)論 耳部與腹部皮下瘤模型在藥物血管滲透效果上各有優(yōu)劣，這兩種模型都為腫瘤藥物血管滲透過程的研究提供了新方法。

[關(guān)鍵詞]腫瘤模型；共聚焦顯微鏡；活體；藥物滲透

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）5（c）-0004-04

Feasibility of laser confocal microscope observation of tumors at different inoculation sites

PIAO Ying DU Rong YU Han-zhi JIANG Xiang-hong

College of Chemical and Biological Engineering， Bio-nano Engineering Center， Zhejiang University， Hangzhou 310012， China

[Abstract] Objective To compare the feasibility and applicability of laser confocal microscoe for in situ observation of drug intratumoral micro-behavior in mice with abdominal subcutaneous tumors and ear subcutaneous tumors， so as to provide a better method for in situ observation of drug penetration in tumors. Methods The murine breast cancer cell line 4T1 transfected with green fluorescent protein （GFP） （4T1-GFP） was cultured in vitro. 4T1-GFP cells were subcutaneously injected into the abdominal subcutaneous vein or ear vein of female ICR mice aged 6-8 weeks. When the tumors grow to 4-7 mm3， the mice would be operated on and the tumors will be pasted on the slide. Cy5-labeled nano-drugs were injected into mice via tail vein， and programmed image acquisition was performed by confocal laser microscope. Results The optimal concentration of tumor cells was （2-3）×104/μl for ear tumor inoculation， the tumors could be used for experiments from the second day. And the optimal concentration of tumor cells was （1-2）×104/μl for abdominal subcutaneous inoculation， the tumors could be used for experiments from the third day. Tumors with less vascular branches and disc-like growth were more conducive to drug-mediated angiosmosis imaging. The model of ear and abdominal subcutaneous tumors could well show the process of drug penetration. Conclusion The models of ear and abdominal subcutaneous tumors have their own advantages and disadvantages in drug vascularization. Both models provide a new method for the study of drug vascularization in tumors.

[Key words] Tumor model； Confocal microscopy； Living body； Drug penetration

腫瘤造模是腫瘤研究的重要手段，對于深入研究人腫瘤細胞的生物學特性、細胞行為學及其基因調(diào)控具有重要意義[1-2]。腫瘤藥物通過血管輸送到達目的部位，從而產(chǎn)生療效[3]。但這其中存在限速步驟，主要是抗腫瘤藥物在腫瘤部位蓄積濃度較低，毒副作用較大是這些藥物面臨的主要問題[4]，與此同時，藥物在腫瘤內(nèi)的滲透等行為也直接影響其藥效[5]。目前的實驗手段大多為小鼠腫瘤建模后摘取腫瘤組織進行切片染色，觀察藥物在某個時間點的滲透情況[6]。小動物活體成像儀可以實時觀測熒光標記藥物的腫瘤內(nèi)宏觀濃度，但不能觀察該藥物在腫瘤內(nèi)部微環(huán)境的微觀行為[7]。而激光共聚焦顯微鏡的應用，實現(xiàn)了對藥物在動物原位腫瘤模型的血管內(nèi)滲透過程的實時觀察，這有利于直觀地動態(tài)觀察整個腫瘤事件[8]。近年來，激光共聚焦顯微鏡技術(shù)與小動物活體成像技術(shù)的結(jié)合，已經(jīng)在腫瘤的基因治療、臨床診斷、干細胞研究等方面發(fā)揮了重要作用[3，8-9]。這種方法優(yōu)勢明顯，但也存在短板，如顯微鏡激發(fā)光波長較短，組織對其吸收和折射較大，使組織滲透深度有限，多數(shù)情況下只能用于淺表組織的檢測[8-9]。因此，目前在腫瘤藥物滲透研究中，一般只能制備皮下瘤模型來實現(xiàn)激光共聚焦觀測。生物體不同部位具有不同的生理特性，故不同部位的皮下腫瘤模型在腫瘤藥物滲透研究中有共同點和不同之處。本研究著眼于小鼠耳部皮下瘤和腹部皮下瘤兩種模型，探討用激光共聚焦顯微鏡觀測腫瘤藥物滲透過程的優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

1.1.1實驗動物

選取ICR雌性小鼠，5～6周齡，體重18～20 g，購于上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司[SCXK（滬）2017-0012]，飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)科院SPF級動物房中，所有實驗均符合實驗動物倫理要求。動物合格證號：0369083。

1.1.2 實驗材料

鼠源乳腺癌細胞系4T1購自南京科佰生物科技有限公司（貨號：CBP60352），穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的小鼠乳腺癌細胞4T1（4T1-GFP）購自上海美軒生物科技有限公司（貨號：MXC018），胎牛血清購自普諾賽生命科技有限公司（貨號：164210-500），1640培養(yǎng)基購自Thermo公司（貨號：C11875500BT），細胞培養(yǎng)瓶、無菌離心管等細胞實驗相關(guān)耗材購自Thermo公司，激光共聚焦顯微鏡為日本NIKON A1型號。尾靜脈注射藥物為接Cy5的聚乙二醇（PEG）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)小鼠4T1-GFP腫瘤細胞，用1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）放置于5% CO2，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，用PBS洗滌兩次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基終止消化，用移液管吹打均勻，細胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml無菌離心管中，900 r/min離心3 min，棄去上清，加入PBS，吹打混勻，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度。

1.2.2 腫瘤模型制備

腹腔注射阿福?。w積分數(shù)為1.25%）麻醉小鼠，注射劑量為每千克體重12.5 ml。麻醉后即可接種腫瘤細胞至耳部和腹部皮下。

1.2.2.1耳部接種腫瘤 將細胞配制成濃度為1×104/μl、2×104/μl、3×104/μl的細胞懸液，分別注射于3只小鼠左右兩只耳部皮下。接種時針頭扎進兩層耳部皮膚之間的血管旁，小心緩慢推入腫瘤細胞，使細胞懸液慢慢充盈到兩層皮膚間隙，直至內(nèi)壓過大使懸液從針頭處外溢時即可停止注射，可注射體積約為20 μl。

1.2.2.2腹部皮膚接種腫瘤 將濃度為1×104/μl、2×104/μl、3×104/μl的細胞懸液，分別注射于3只小鼠左右兩側(cè)腹部皮下的大血管旁，接種時針頭扎進皮下而非腹腔，注意避免刺破血管，注射體積為50 μl左右。

接種過后，待小鼠麻醉消除可放回鼠籠繼續(xù)飼養(yǎng)，待每天觀察腫瘤生長情況，測量腫瘤體積大小。待腫瘤生長至合適大小便可實施成像。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡對荷瘤小鼠成像

1.2.3.1小鼠耳部腫瘤成像準備 將實驗鼠實施麻醉，并對鼠耳部位用酒精棉球擦拭消毒（有毛鼠要對耳部及周邊脫毛），然后將耳蝸側(cè)鋪貼于載玻片上，在鼠耳腫瘤部位與載玻片之間滴一小滴甘油（注意避免甘油產(chǎn)生氣泡），最后用502膠將耳部邊緣粘貼于載玻片上，粘貼時盡量將耳部伸展并與玻片貼合無縫。

1.2.3.2小鼠腹部皮下瘤成像準備 去除實驗鼠腹部毛發(fā)并將其麻醉，將小鼠仰面放置于加熱墊上。用棉球蘸碘伏對腹皮進行消毒，用眼科剪沿腹中線剪開腹皮，用鑷子慢慢剝離上皮與腹腔膜之間的筋膜，避免誤傷大血管，最后用502膠將剪開的腹皮邊緣粘貼于載玻片上，粘貼時盡量延伸腹皮將其無縫貼合于載玻片上。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad prism 5.0對腫瘤生長情況進行統(tǒng)計分析，用Image J對藥物在腫瘤部位的滲透程度進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1不同接種部位成瘤情況的比較

耳部皮下接種和腹部皮下接種在接種部位形成腫瘤，成瘤率為100%，但由于部位不同，其生理環(huán)境條件不同，導致腫瘤生長速度和大小均有不同。

耳部皮膚較薄，兩片皮膚之間的組織間隙很小，能夠注射進去的腫瘤細胞懸浮液體積也較小，大約20 μl。為較快獲得可用于成像的耳部皮下瘤模型，需要接種濃度較高的腫瘤細胞。當注射濃度為1×104/μl時，腫瘤體積增長緩慢，到第4天為4 mm3左右；2×104/μl組和3×104/μl組腫瘤體積則相對較大，在第2～4天能達到4～7 mm3大小，故更適合成像（圖1A，見封四）。成瘤細胞數(shù)在裸鼠和白鼠間存在差異，白鼠免疫力強，腫瘤后期會被機體慢慢清除，需要在腫瘤快速生長期進行成像。

與耳部皮膚比較，腹部皮膚較為松弛，可以接種腫瘤細胞的體積約為50 μl。接種后腫瘤生長迅速，第3天1×104/μl組和2×104/μl組的腫瘤體積可達到5 mm3左右，能用于成像觀察；而3×104/μl組接種后第1天腫瘤體積就達到5 mm3以上，之后幾天體積增速較快，腫瘤血管過密，而后在機體免疫下體積變小（圖1B，見封四），所以并不適合觀察腫瘤血管藥物的滲透過程。

2.2 腫瘤的最佳成像條件

2.2.1腫瘤大小對觀察藥物滲透的影響

用激光共聚焦顯微鏡對腫瘤血管藥物滲透過程進行成像時，只能用4倍或10倍的物鏡鏡頭，放大倍數(shù)不宜太大，否則成像模糊。腫瘤體積在3～5 mm3即可觀察到腫瘤全貌以及周邊血管與腫瘤相接的絕大部分或全部（圖2A）；若不需要觀察腫瘤全貌，腫瘤可以更大，隨之腫瘤血管也更加豐富。

2.2.2瘤內(nèi)血管分支的影響

在觀察藥物滲透情況時，以看到主血管及同一層面的腫瘤為宜，以便于觀察大血管向腫瘤內(nèi)部滲透的情況。腫瘤實質(zhì)不宜有太多分支血管（圖2A），分支血管太密則無法統(tǒng)計藥物滲透深度。若以觀察腫瘤新生血管為目的時則不必限制血管生長密度，一般>5 mm3的腫瘤其分支血管會較為密集（圖2B）。

2.2.3皮下成瘤部位對滲透實驗的影響

耳部腫瘤包饒正常血管生長，不存在成像時腫瘤與血管不在一個平面的問題（圖2C）；但腹部接種時由于皮下組織間隙大，以及組織隔膜層數(shù)多，使得腫瘤常常游離于目標血管之外，成像時腫瘤和血管不一定處于同一層面（圖2D），故不利于成像。

2.2.4腫瘤形狀對成像的影響

耳部腫瘤一般由于皮膚張力與壓力會呈現(xiàn)圓盤狀生長，有利于成像（圖2C）；而腹部腫瘤往往呈球狀生長，在腫瘤接種后可以多次按壓接種部位使其盡量扁平地生長。

2.3 鼠耳部與腹部拍攝效果對比

耳部成瘤有諸多優(yōu)點，但同時也存在缺點，其中最大的問題就在于皮膚毛囊對成像的影響。毛囊在視野下呈現(xiàn)圓形暗區(qū)且數(shù)量多，常阻擋關(guān)鍵視野和部位（圖3A，圖4A，見封四），因此，用去毛膏去掉小鼠的毛發(fā)，或使用裸鼠，可以獲得更好的成像效果（圖3B，見封四），從而更好地反映藥物血管滲透過程（圖4A，見封四）?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著時間延長，藥物逐漸滲透入腫瘤組織深部（圖4B，見封四）。腹部成像規(guī)避了毛囊干擾視野的問題，也能夠較好地觀察到藥物滲透的過程（圖5，見封四），但往往由于腹膜干擾，或腫瘤與血管的相對位置不理想，導致成像效果不一定清晰。

3 討論

皮下移植腫瘤模型，是指將腫瘤細胞直接注射至小鼠皮下部位形成腫瘤的實驗樣本，是研究腫瘤生物學特性、腫瘤藥物作用機理、優(yōu)化腫瘤診療方法的重要工具[10-11]。本研究選用穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的小鼠乳腺癌細胞株4T1-GFP，在小鼠皮下腫瘤造模沒有任何免疫排斥性。該細胞株增殖迅速，能夠在較短時間內(nèi)獲得實驗模型，縮短實驗周期[12]。用于活體共聚焦成像的皮下瘤模型的成功建立受諸多因素的影響[13-14]，包括腫瘤細胞的接種數(shù)目、腫瘤血管密度、腫瘤形狀等因素。隨著腫瘤體積增長，新生血管分枝增多且密集，導致其內(nèi)部某一部位蓄積的藥物由多根分支血管滲透完成，無法統(tǒng)計該藥物的滲透能力。因此，控制腫瘤血管的密度，對于藥物滲透研究至關(guān)重要[15]。此外，腫瘤包繞血管生長的方式有助于共聚焦顯微鏡成像時進行斷層掃描，以獲取“光學切片”[16]，而游離于血管之外獨立生長的腫瘤在成像掃描中難以與血管聚焦于同一層面，由此可見，腫瘤與血管的相對生長位置是影響成像質(zhì)量的關(guān)鍵點[17-18]。

經(jīng)過一系列摸索，本課題組成功地將4T1-GFP移植到ICR小鼠皮下不同部位，建立了兩種可用于研究腫瘤藥物滲透過程的小鼠皮下瘤模型[19-21]，一種是鼠耳皮下瘤模型，另一種是腹部皮下瘤模型。兩者在構(gòu)建操作、成像難度、成像效果以及動物倫理等方面各有優(yōu)劣。

鼠耳皮下瘤模型的優(yōu)勢在于：①成像前不需要手術(shù)，可直接用于成像；②腫瘤容易包繞血管生長，利于共聚焦成像；③從倫理角度來講，這種方法減少了實驗動物所遭受的痛苦，實驗后死亡率大大降低，生存質(zhì)量提升。與此同時，其劣勢也十分明顯，主要在于：①耳部毛囊在鏡下清晰可見，對拍攝效果有一定程度的影響；②隔著一層耳部皮膚進行成像，導致其清晰度降低。腹部皮下瘤模型的優(yōu)勢：①接種操作簡單；②腹部血管比耳部粗大，成瘤更快；③成像視野干凈，無毛囊等結(jié)構(gòu)阻擋視野。其劣勢：①在大多數(shù)情況下，腫瘤未能包繞血管生長而不能清晰成像；②對實驗動物損傷較大，需要手術(shù)之后成像，客觀上會使死亡率上升。

本研究通過對兩種皮下瘤模型建立過程中成瘤時間及特性等因素的把控，成功構(gòu)建了操作簡便的用于共聚焦成像的皮下瘤模型，實現(xiàn)了對納米藥物滲透過程的觀察[22]，這個過程包含了藥物從血液滲透進入腫瘤外部組織，最終在整個腫瘤部位分散開，使研究者對腫瘤藥物的滲透有一個直觀了解。兩種皮下瘤模型的建立為腫瘤藥物治療提供了良好的動物模型及平臺。但是，這種方法目前還存在一定的局限性，主要包括兩方面。①我們只能觀察到腫瘤外部大血管與腫瘤邊界的藥物滲透過程，而看不到腫瘤內(nèi)部新生血管向細胞外基質(zhì)甚至是腫瘤細胞的滲透過程；②目前最大視野只能拍攝到10倍物鏡大小，若再提高放大倍數(shù)，會導致成像清晰度降低。有鑒于此，我們暫時尚不能實現(xiàn)對藥物滲透腫瘤的亞細胞過程進行在體實時觀察。

綜上所述，本研究還有待于進一步深入探索，以期為腫瘤治療提供更多有效的指導。

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（收稿日期：2019-03-12 本文編輯：許俊琴）