雷蕾，王璐，姚麗娜，郝心愿，曾建明，丁長(zhǎng)慶，王新超，楊亞軍

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茶樹(shù)鈣依賴性蛋白激酶基因的鑒定及表達(dá)分析

雷蕾，王璐，姚麗娜，郝心愿，曾建明，丁長(zhǎng)慶*，王新超*，楊亞軍

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹(shù)改良中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008

鈣依賴型蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinases，CDPKs或CPKs）是植物細(xì)胞中重要的鈣離子信號(hào)受體，普遍參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)等調(diào)控過(guò)程。本研究從茶樹(shù)龍井43中克隆到1條基因，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證該序列包含1?611?bp的完整ORF，編碼536個(gè)氨基酸。結(jié)合序列比對(duì)和進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該蛋白N-末端具有豆蔻?；稽c(diǎn)，具備鈣依賴性蛋白激酶的保守結(jié)構(gòu)域，并且與擬南芥AtCDPK17的同源關(guān)系最近，因此命名為CsCDPK17（Genbank登錄號(hào)為：MK238482）。蛋白質(zhì)理化特性分析發(fā)現(xiàn)其蛋白分子量為59.9?kD，理論等電點(diǎn)pI為5.43，屬無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性蛋白。使用水稻原生質(zhì)體和煙草葉片兩種瞬時(shí)表達(dá)的方法均證明CsCDPK17是細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核雙定位蛋白。對(duì)克隆到的上游2?000?bp的啟動(dòng)子區(qū)分析發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與基因轉(zhuǎn)錄、光、激素（ABA、SA、MeJA等）相關(guān)的順式作用元件。表達(dá)分析顯示，在成熟葉和種子中表達(dá)水平較高，而在根中的表達(dá)水平最低；在龍井43、大面白等4個(gè)品種冷馴化過(guò)程中，該基因的表達(dá)隨著冷馴化過(guò)程顯著上調(diào)，隨著脫馴化過(guò)程下調(diào)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)能夠不同程度地響應(yīng)低溫（最高5.1倍）、干旱（最高2.3倍）、滲透（最高2.4倍）脅迫。本研究的結(jié)果表明在茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育和低溫、干旱、滲透等非生物脅迫響應(yīng)的過(guò)程中均發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

茶樹(shù)；基因；亞細(xì)胞定位；非生物脅迫；表達(dá)分析

鈣離子是植物細(xì)胞中最重要的第二信使之一，幾乎所有的真核生物細(xì)胞中都存在鈣離子信號(hào)通路。高等植物中，鈣離子信號(hào)通路普遍參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)等調(diào)控過(guò)程[1]。植物細(xì)胞膜系統(tǒng)在感受到外界環(huán)境刺激后，首先引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的瞬時(shí)變化，隨后鈣信號(hào)受體感知這種變化并將信號(hào)傳遞至下游的調(diào)控網(wǎng)路，進(jìn)而引起植物細(xì)胞內(nèi)的一系列生理、生化變化，完成對(duì)各種環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)[2]。植物細(xì)胞中的鈣離子信號(hào)受體主要有鈣調(diào)素（Calmodulins，CaM）及鈣調(diào)素相關(guān)蛋白（Calmodulins-related proteins，CML）、類似鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白（Calcineurin B-like proteins，CBL）和鈣依賴性蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinases，CDPK，又稱CPK）三大類[2-3]。與CaM及CML、CBL不同，CDPK在植物細(xì)胞中同時(shí)發(fā)揮著鈣離子信號(hào)受體和傳遞體的雙重功能[4]。鈣依賴性蛋白激酶是一類Ser/Thr型蛋白激酶，通常都是由N-端的可變功能域（N-terminal domain）、蛋白激酶功能域（Protein kinase domain）、自抑制功能域（Autoinhibitory domain）和C端的類鈣調(diào)素功能域（Calmodulin like domain）4個(gè)核心功能域構(gòu)成[1]。其中，C端的類鈣調(diào)素功能域是由成對(duì)的螺旋-環(huán)-螺旋狀的EF-hand手型結(jié)構(gòu)組成，Ca2+與EF-手型結(jié)構(gòu)的結(jié)合能夠引起CDPK空間結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致自抑制功能域的抑制作用解除，促使CDPK的蛋白激酶活性恢復(fù)，磷酸化下游調(diào)控因子，將信號(hào)傳遞至下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而完成對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境刺激等信號(hào)的響應(yīng)[5]。

植物細(xì)胞中鈣依賴性蛋白激酶通常是由包含多個(gè)成員的基因家族編碼，例如：在擬南芥、水稻、玉米和毛果楊的基因組中分別鑒定出34、31、25個(gè)和20個(gè)CDPK基因[6-9]。茶樹(shù)中，張成才[10]發(fā)現(xiàn)了5條在茶樹(shù)花粉中特異表達(dá)的CDPK基因，并命名為；Wang等[11]發(fā)現(xiàn)可能參與了茶樹(shù)對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)。已有研究表明，在各物種響應(yīng)脅迫的過(guò)程中既存在發(fā)揮正向調(diào)控作用的CDPK基因，也存在起負(fù)調(diào)控作用的CDPK家族成員。例如：小麥中等基因均受到白粉病誘導(dǎo)表達(dá)[12]；水稻中過(guò)表達(dá)可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的低溫抗性[13]；玉米中過(guò)表達(dá)能夠?qū)е缕浞N子萌發(fā)對(duì)ABA更加敏感，同時(shí)也能增加轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱的抗性[14]；而擬南芥突變體表現(xiàn)出比野生型更強(qiáng)的滲透脅迫抗性[15]。

茶樹(shù)［(L.) O. Kuntze］起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種喜溫怕寒的多年生常綠木本植物，在其總生育周期和年生育周期內(nèi)都會(huì)受到低溫、干旱、高溫等各種環(huán)境因素的影響[16]。近年來(lái)，夏季高溫和早春倒春寒災(zāi)害對(duì)我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)的影響愈發(fā)嚴(yán)重，茶樹(shù)抗逆育種也成為了當(dāng)下育種界關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。因此，加強(qiáng)對(duì)茶樹(shù)重要功能基因的挖掘及功能研究，促進(jìn)茶樹(shù)豐富種質(zhì)資源和基因資源的利用是推動(dòng)茶樹(shù)抗逆育種的重要手段之一[17]。在前期工作的基礎(chǔ)上，我們從茶樹(shù)中克隆出1條編碼鈣依賴性蛋白激酶的基因，并深入分析了該基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件構(gòu)成，編碼蛋白的理化特性、結(jié)構(gòu)特征和亞細(xì)胞定位，檢測(cè)了其對(duì)多種非生物脅迫的響應(yīng)情況，以期豐富茶樹(shù)CDPK家族的基因信息，也為茶樹(shù)非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以5年生盆栽（花盆直徑約45?cm，高度約40?cm）的國(guó)家級(jí)無(wú)性系良種龍井43為材料，取其根、莖、成熟葉、頂芽、花和果實(shí)用于組織特異性表達(dá)試驗(yàn)，其中花和果實(shí)采于2018年10月下旬盛花期間；逆境處理?xiàng)l件如下：盆栽于人工氣候室中適應(yīng)培養(yǎng)7?d（光周期為14?h光照、10?h黑暗，溫度為白天25℃、夜間22℃），然后開(kāi)始進(jìn)行低溫、干旱等非生物脅迫處理。低溫處理時(shí)保持光周期不變，調(diào)整溫度為白天4℃、夜間2℃，以低溫處理前為對(duì)照，定義為0?h，低溫處理后1、3、6、12、24、48、72?h分別取第1至2片葉為樣品；干旱處理和滲透脅迫處理分別采用聚乙二醇（PEG 6000）和甘露醇模擬，處理時(shí)向每一盆栽苗澆灌5%（∶）PEG 6000或者150?mmol·L-1甘露醇1?000?mL，以處理前為對(duì)照定義為0?d，處理后的0.5、2、4、6、8?d分別取第1至2片葉為樣品。以田間自然生長(zhǎng)的龍井43、大面白、浙農(nóng)12和浙農(nóng)113為材料，在2017—2018年分別于2017年10月14日和12月16日及2018年的1月17日和3月27日取成熟葉用于檢測(cè)目標(biāo)基因在不同茶樹(shù)品種冷馴化過(guò)程中的表達(dá)分析。所有處理均設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)，取樣后立即放入液氮，然后保存于–80℃冰箱備用。

1.2 DNA、RNA的提取及cDNA的合成

分別選用高效植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，中國(guó)）和RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，中國(guó)）進(jìn)行DNA和RNA抽提，具體的操作過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。抽提好的DNA、RNA分別使用Nano Drop ND2000微量核酸蛋白測(cè)定儀（Thermo，美國(guó)）進(jìn)行濃度測(cè)定和1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。經(jīng)檢測(cè)合格的DNA保存于–20℃冰箱，用于啟動(dòng)子克?。籖NA保存于–80℃冰箱，用于cDNA合成。取1?μg RNA使用Prime Script RT Reagent（Takara，日本）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)完成cDNA合成，保存于–20℃冰箱，用于基因克隆和表達(dá)分析等后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 基因CDS全長(zhǎng)及啟動(dòng)子克隆

使用龍井43的cDNA為模板，以在轉(zhuǎn)錄組中通過(guò)同源比對(duì)得到的候選序列為參考，設(shè)計(jì)引物使用RT-PCR進(jìn)行基因全長(zhǎng)克隆驗(yàn)證。基因克隆選用KOD-Plus-Neo（Toyobo，日本）高保真Taq酶，PCR反應(yīng)體系為50?μL，包括以下組分：以10倍稀釋的上述cDNA 1.0?μL為模板、10×KOD buffer 5.0?μL、上下游引物各1.5?μL、dNTP 5.0?μL、KOD-Plus-Neo 1.0?μL、MgSO44.0?μL，其余用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋菏紫冉?jīng)94℃預(yù)變性3?min；然后98℃變性10?s，56℃退火30?s，68℃延伸90?s，38個(gè)循環(huán)；68℃延伸7?min，于4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后的RCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)目標(biāo)條帶切膠回收，連接到Blunt-zero（TransGen，中國(guó)）克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌，涂板后37℃培養(yǎng)12~14?h，挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證?；谝呀?jīng)發(fā)表的舒茶早基因組序列信息[18]，通過(guò)比對(duì)獲得目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（ATG）前約2?000?bp的啟動(dòng)子區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物，以龍井43的DNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收、連接入克隆載體、涂板挑取單克隆測(cè)定啟動(dòng)子區(qū)序列。引物合成和測(cè)序由上海華津生物有限公司完成，本研究中涉及的引物及序列見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)中用到的引物及其序列

1.4 生物信息學(xué)分析

利用DNASTAR 5.01軟件包中的Editseq對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)；在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)其進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并根據(jù)文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道的CDPK基因序列的GeneBank編號(hào)，下載氨基酸序列，使用ClustalX 2.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；采用MEGA 6.0軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining tree）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（使用Bootstrap檢驗(yàn)，值為1?000），完成對(duì)目標(biāo)蛋白的進(jìn)化分析。使用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam）預(yù)測(cè)蛋白分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組分等特征；使用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale）程序分析該蛋白的疏水和親水性；SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析程序預(yù)測(cè)該蛋白的信號(hào)肽；NetPhos 3.1 Server（www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）分析程序預(yù)測(cè)蛋白磷酸化位點(diǎn)；使用Myristoylator（https://web.expasy.org/myristoylator）預(yù)測(cè)N端的豆蔻酰化位點(diǎn)；使用TMHMM sever 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；使用SOPMA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；使用PSORT（https://www.psort.org）進(jìn)行CsCDPK17蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）完成CsCDPK17蛋白的功能與分析；Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org）完成三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并用Pymol 2.0.7軟件作圖。使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）完成對(duì)啟動(dòng)子所含順式作用元件的分析。

1.5 CsCDPK17編碼蛋白的亞細(xì)胞定位

1.5.1 載體構(gòu)建

首先，使用帶酶切位點(diǎn)的CsCDPK17-GFP- F/CsCDPK17-GFP-R引物，擴(kuò)增CsCDPK17編碼序列，切膠回收后備用。然后使用I和I內(nèi)切酶分別對(duì)CsCDPK17編碼序列膠回收產(chǎn)物和35s-eGFP載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收酶切產(chǎn)物。最后將酶切后CsCDPK17編碼序列與載體質(zhì)粒的回收產(chǎn)物使用T4 DNA ligase進(jìn)行連接，完成CsCDPK17-eGFP載體構(gòu)建，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入DH5，涂板挑選單克隆，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆后送上海華津生物有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.5.2 CsCDPK17-eGFP的煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)

將測(cè)序驗(yàn)證正確的CsDPK17-eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（GV3101），28℃培養(yǎng)36~48?h后，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆的菌液以1∶1的比例加入50%的甘油于–80℃保存。使用水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)法和煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)的方法進(jìn)行目標(biāo)基因的亞細(xì)胞定位研究。煙草浸染液制備方式為：首先，取–80℃保存的菌液（GV3101）10?μL于1?mL的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200?r·min-1活化培養(yǎng)3?h；然后，將活化好的菌液按1%比例加入到25?mL（含50?ng·mL-1卡那霉素和50?ng·mL-1利福平）的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約1.0（約需要24~36?h）；最后，將培養(yǎng)好的菌液4?000?r·min-1離心10?min，棄去上清，用侵染液（含10?mmol·L-1MES、10?mmol·L-1MgCl2，使用1?mol氫氧化鉀調(diào)pH至5.7）重懸至OD600=0.8，28℃靜置3?h后注射煙草。注射后48?h左右使用激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照。

1.6 CsCDPK17的表達(dá)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CsCDPK17的克隆

使用CsCDPK17-F和CsCDPK17-R引物以龍井43的cDNA為模板成功擴(kuò)增出1條1?600?bp左右的條帶（圖1），經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含一段全長(zhǎng)為1?611?bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼1條長(zhǎng)度為536個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源比對(duì)結(jié)果顯示，該蛋白與擬南芥中的AtCPK17的同源性高達(dá)82.5%，其次為AtCPK34，因此，命名該基因?yàn)椋℅enBank登錄號(hào)為MK238482）。

圖1 茶樹(shù)CDPK家族基因CsCDPK17電泳結(jié)果

2.2 進(jìn)化和保守功能域分析

為了探究該基因與其他物種中已經(jīng)發(fā)表的CDPK蛋白之間的親緣關(guān)系，我們使用鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，該進(jìn)化樹(shù)包含有4個(gè)亞家族聚類，CsCDPK17與CsCDPK2、CmCDPK2、AtCDPK17等蛋白聚類于第二亞家族（圖2），說(shuō)明這些蛋白之間具有較近的親緣關(guān)系。為了進(jìn)一步解析CsCDPK17的結(jié)構(gòu)和推測(cè)其生物學(xué)功能，通過(guò)與水稻、擬南芥等模式植物中CDPK氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，各物種間CDPK在N端序列的差異性較大，符合CDPK的N端是可變結(jié)構(gòu)域的特性（圖3）。N-末端豆蔻?；稽c(diǎn)分析顯示CsCDPK17與AtCPK2、McCDPK2的同源性較高，說(shuō)明他們可能具有相似的亞細(xì)胞定位。蛋白磷酸化預(yù)測(cè)該蛋白可能有41個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包含20個(gè)絲氨酸（Ser）位點(diǎn)、15個(gè)蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)和6個(gè)絡(luò)氨酸（Tyr）位點(diǎn)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析顯示，CsCDPK17蛋白在其氨基酸序列80~338位之間為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，在C端的385~413、421~449、457~485、492~520這4個(gè)位點(diǎn)存在有4個(gè)EF-hand手型結(jié)構(gòu)（圖3）。通過(guò)與已經(jīng)報(bào)道的結(jié)構(gòu)域較為明確的CDPK氨基酸序列[21]比對(duì)分析也證實(shí)了上述分析結(jié)果。綜上，CsCDPK17在激酶結(jié)構(gòu)域、自抑制功能域、ATP結(jié)合位點(diǎn)及C端的4個(gè)EF-hand手型結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)出較高的保守性，推測(cè)該蛋白可能具有類似的激酶活性。

2.3 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

CsCDPK17蛋白大小為59.9?kD，理論等電點(diǎn)pI為5.43，化學(xué)分子式為C2632H4146N736O813S26。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)CsCDPK17的脂肪指數(shù)為77.23，不穩(wěn)定系數(shù)為38.60，根據(jù)Guruprasad法判斷該蛋白為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的親、疏水性通常與功能密切相關(guān)，分析顯示該蛋白極性最小負(fù)值為–3.011，最大正值為2.756，總平均親水性（GRAVY）為–0.525，屬于親水性蛋白。另外，信號(hào)肽的分析顯示CsCDPK17蛋白的S平均值（Mean S-score）為0.100（小于0.5），說(shuō)明其可能為分泌蛋白；進(jìn)一步的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，該蛋白不存在跨膜區(qū)，不屬于跨膜蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CsCDPK17可能定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分析表明：-螺旋占41.98%；延伸鏈占9.33%；-轉(zhuǎn)角占8.58%；無(wú)規(guī)則卷曲占40.11%。圖4是CsCDPK17的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型。

注：McCDPK2：苦瓜；CmCDPK34：甜瓜；CmCDPK2：甜瓜；CsCDPK2：茶樹(shù)；CsCDPK17：茶樹(shù)；AtCPK17：擬南芥；OsCPK12：水稻；AtCPK21：擬南芥；LeCPK1：番茄；NtCPK1：煙草；OsCPK17：水稻；CsCDPK20：茶樹(shù)；OsCPK24：水稻；ZmCPK11：玉米；OsCPK7：水稻；CsCDPK26：茶樹(shù)；StCDPK5：馬鈴薯；OsCPK13：水稻；ZmCDPK1：玉米；ZmCPK4：玉米；AtCPK8：擬南芥；AtCPK10：擬南芥；PeCPK10：胡楊；AtCPK16：擬南芥；OsCPK4：水稻；MaCDPK3：野芭蕉

注：兩個(gè)藍(lán)色箭頭之間的氨基酸序列為蛋白激酶功能域；紅色下劃線表示ATP結(jié)合位點(diǎn)，紅色箭頭表示與ATP結(jié)合的氨基酸為賴氨酸（K）；黑色下劃線依次表示N端的豆蔻酰化位點(diǎn)、自抑制功能域和C端的4個(gè)EF-hand手型結(jié)構(gòu)

圖4 CsCDPK17的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型

2.4 CsCDPK17基因啟動(dòng)子序列分析

啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的數(shù)量和種類是基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的重要方式，對(duì)克隆出的起始密碼子上游約2?000?bp的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄所必須的元件（如與轉(zhuǎn)錄起始相關(guān)的核心元件TATA-box、CAAT-box等）、多個(gè)與光響應(yīng)相關(guān)的元件（如G-box、Box4等）、多個(gè)與激素響應(yīng)相關(guān)的元件（如與脫落酸相關(guān)的ABRE、與茉莉酸相關(guān)的CGTCA-motif元件、與生長(zhǎng)素相關(guān)的AuxRR-core）等；此外還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與非生物脅迫響應(yīng)、類黃酮代謝相關(guān)的TC-rich repeats、MBSI等元件（圖5和表2）。啟動(dòng)子區(qū)廣泛存在的各種類型的轉(zhuǎn)錄因子說(shuō)明該基因可能普遍參與了茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)等調(diào)控過(guò)程。

2.5 亞細(xì)胞定位

使用水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)法對(duì)CsCDPK17的亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，與該蛋白融合的GFP熒光在原生質(zhì)膜和細(xì)胞核上均有發(fā)現(xiàn)（圖6），說(shuō)明該蛋白具有細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核雙定位。為了進(jìn)一步確認(rèn)該定位的準(zhǔn)確性，我們又使用了煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果同樣表明CsCDPK17是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)膜雙定位蛋白（圖6）。CsCDPK17在細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核的雙定位模式說(shuō)明其在生物學(xué)功能上可能同時(shí)具有細(xì)胞膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和核基因表達(dá)水平調(diào)控的雙重功能。

2.6 CsCDPK17基因的表達(dá)模式分析

2.6.1 組織表達(dá)特異性

組織表達(dá)特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，基因在各組織中的表達(dá)水平均明顯低于內(nèi)參基因。不同組織之間，在成熟葉和種子中的表達(dá)水平較高，根中的表達(dá)量最低，在第一葉、花、芽、莖中的表達(dá)量居中（圖7），表明在成熟葉和種子中呈現(xiàn)出明顯的特異性表達(dá)。

2.6.2 不同脅迫處理下的表達(dá)模式

對(duì)龍井43、大面白、浙農(nóng)12和浙農(nóng)113這4個(gè)品種自然冷馴化（越冬）和脫馴化過(guò)程的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在自然冷馴化期間（10月至次年1月），基因表達(dá)水平隨著氣溫逐漸降低而逐漸提高，1月17號(hào)時(shí)在4個(gè)品種中的表達(dá)水平均達(dá)到最高，并且在4個(gè)品種中呈現(xiàn)出相同的表達(dá)模式；在脫馴化（次年1月至3月份）過(guò)程中，表達(dá)水平隨著氣溫的升高又顯著降低（圖8-A）。上述結(jié)果說(shuō)明可能參與了茶樹(shù)冷馴化和脫馴化過(guò)程的調(diào)控，這也與我們前期發(fā)現(xiàn)的鈣離子信號(hào)通路參與了茶樹(shù)冷馴化的調(diào)控這一結(jié)果相符[22]。

低溫條件下，在茶樹(shù)新梢中的表達(dá)與4℃低溫處理的時(shí)間密切相關(guān)，短時(shí)間的低溫處理并不能誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，低溫處理24?h后開(kāi)始顯著上調(diào)表達(dá)，約為對(duì)照（0?h）的2.2倍；隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，72?h時(shí)表達(dá)與對(duì)照相比上調(diào)了約5.1倍，上述結(jié)果說(shuō)明的表達(dá)受到低溫的誘導(dǎo)（圖8-B）。

干旱脅迫條件下，使用PEG處理2?d后基因的表達(dá)顯著上調(diào)，約為處理前的2.3倍，說(shuō)明參與了干旱脅迫的響應(yīng)。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，可能是由于茶樹(shù)對(duì)干旱脅迫產(chǎn)生了一定程度的適應(yīng)性，表達(dá)在處理后的4~8?d逐漸下調(diào)至與處理前無(wú)顯著差異的水平（圖8-C）。

注：圖中標(biāo)注了MYB、MYC結(jié)合位點(diǎn)，序號(hào)j~s、黑色方框及紅色方框與表2中的順式作用元件相對(duì)應(yīng)

表2啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件分析

Fig 2 Analysis of the-acting elements inpromoter region

注：數(shù)據(jù)分析采用Mean with SEM方法，方差分析采用LSD法，柱上小寫(xiě)字母不同表示差異達(dá)顯著水平（P<0.05）

滲透脅迫條件下基因的表達(dá)模式與干旱脅迫類似，在處理后的2~4?d基因顯著上調(diào)表達(dá)，均達(dá)到處理前的2.4倍左右，說(shuō)明基因也參與了茶樹(shù)對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)（圖8-D）。

3 討論

本研究從茶樹(shù)中克隆到1條與擬南芥AtCPK17同源的鈣依賴性蛋白激酶編碼基因，并命名為。進(jìn)化樹(shù)分析顯示該蛋白聚類于CDPK家族的第二亞家族，具備鈣依賴性蛋白激酶典型的結(jié)構(gòu)域，即N端可變結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域、自抑制結(jié)構(gòu)域及C端的4個(gè)EF-hand手型結(jié)構(gòu)域。通過(guò)與其他物種中已經(jīng)報(bào)道的CDPK氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，位于CsCDPK17第111號(hào)位點(diǎn)的賴氨酸參與激酶與ATP的結(jié)合；位于385~413、421~449、457~485和492~520這4個(gè)區(qū)域的手型結(jié)構(gòu)可能參與了CsCDPK17與鈣離子的結(jié)合[23]。綜合上述生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CsCDPK17屬于典型的鈣依賴性蛋白激酶。

注：數(shù)據(jù)分析采用Mean with SEM方法，方差分析采用LSD法，柱上小寫(xiě)字母不同表示差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。A：冷馴化；B：低溫；C：干旱；D：滲透脅迫

CDPK家族作為最重要的鈣離子信號(hào)受體之一，各成員在細(xì)胞中的定位并不完全相同。有分析發(fā)現(xiàn)，CDPK蛋白在亞細(xì)胞水平的定位受到其N端可變結(jié)構(gòu)域修飾的影響，N端豆蔻?；欣贑DPK特異性膜靶向定位[24-25]，但是與之直接相關(guān)的試驗(yàn)證據(jù)還不充分。在擬南芥中具有N端豆蔻?；揎椢稽c(diǎn)的AtCPK3/5/20均定位于細(xì)胞質(zhì)膜；而不具有該修飾位點(diǎn)的AtCPK4/11/29等蛋白則是定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中[6]；采用點(diǎn)突變的研究發(fā)現(xiàn)N端豆蔻酰化修飾位點(diǎn)突變后AtCPK2/34不再定位于細(xì)胞質(zhì)膜[26]。本研究中，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)CsCDPK17的N-末端具有豆蔻酰化位點(diǎn)（MGNCCS），推測(cè)其可能具有細(xì)胞質(zhì)膜定位。使用水稻原生質(zhì)體和煙草葉片兩種瞬時(shí)表達(dá)的方法均證實(shí)CsCPK17定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核，揭示CsCDPK17可能同時(shí)參與了細(xì)胞膜Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。

水稻、擬南芥等模式植物中已有的研究表明，CDPK不僅能夠依靠自身的磷酸激酶活性直接參與各種生命活動(dòng)的調(diào)控，還能夠通過(guò)與ABA信號(hào)、ROS信號(hào)通路互作參與生長(zhǎng)發(fā)育和逆境迫響應(yīng)等過(guò)程的調(diào)控[27]。在擬南芥中，有至少12條基因在花器官中特異表達(dá)并且參與了花器官發(fā)育的調(diào)控，例如：與野生型相比，雙突變體的花粉管發(fā)育受到嚴(yán)重的影響，說(shuō)明直接參與了花粉管伸長(zhǎng)調(diào)控[28]；在不同組織中的表達(dá)水平依次為成熟葉、種子、花、第一葉、芽、莖、根，其中在成熟葉和種子的表達(dá)水平顯著高于其他器官，說(shuō)明該基因可能也參與了茶樹(shù)中某些組織器官發(fā)育的調(diào)控。

基因?qū)χ参锩{迫響應(yīng)的調(diào)控作用已經(jīng)被廣泛報(bào)道。擬南芥中，通過(guò)ABA信號(hào)通路介導(dǎo)的氣孔運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱脅迫的抗性[29]。在土豆中，是細(xì)胞質(zhì)膜定位的激酶，該蛋白能夠與同樣定位于細(xì)胞質(zhì)膜的RBOH蛋白（Respiratory burst oxidase homolog protein）相互作用，直接參與土豆細(xì)胞中ROS代謝[30]。過(guò)表達(dá)水稻能夠抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)鹽脅迫的耐受性[31]；過(guò)表達(dá)植株具有更強(qiáng)的低溫抗性，具體表現(xiàn)為脯氨酸含量的增加和GSH/GSSG（還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽）比率的升高[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，自然冷馴化過(guò)程中4個(gè)不同抗寒性的茶樹(shù)品種中均呈現(xiàn)類似的表達(dá)趨勢(shì)，說(shuō)明該基因可能參與了茶樹(shù)越冬過(guò)程中的自然冷馴化調(diào)控，這一結(jié)果也與在成熟葉中表達(dá)水平較高和前期研究發(fā)現(xiàn)的鈣離子信號(hào)通路參與了茶樹(shù)冷馴化過(guò)程的調(diào)控[22]等結(jié)果相一致。在本研究中的低溫、干旱和滲透等脅迫處理下，均表現(xiàn)出不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明該基因在茶樹(shù)的非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮有一定的生物學(xué)功能。同時(shí)，在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)的參與ABA、MeJA、光等信號(hào)響應(yīng)的順勢(shì)作用元件也為該基因生物學(xué)功能的解析提供了參考；另外，前面提到CsCDPK17是細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核雙定位的蛋白激酶，其細(xì)胞核定位也與啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄順勢(shì)調(diào)控元件相符合，可在一定程度上調(diào)控下游基因的逆境脅迫響應(yīng)。在茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)等過(guò)程中具體的功能、其對(duì)鈣離子信號(hào)的感知過(guò)程、下游的磷酸化底物的種類和數(shù)量以及與ABA、ROS等信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián)將會(huì)是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

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Identification and Expression Analysis of Calcium-dependent Protein Kinasein Tea Plant ()

LEI Lei, WANG Lu, YAO Lina, HAO Xinyuan, ZENG Jianming, DING Changqing*, WANG Xinchao*, YANG Yajun

Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Center for Tea Improvement/Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China

Calcium-dependent protein kinases (CDPKs or CPKs) are important calcium sensors in higher plants, which are extensively involved in plant development and stress responding. In this study, one sequence that contained a complete ORF of 1?611?bp encoding a 568 amino acids protein was cloned fromcv.Longjing43. Sequence alignments revealed that this protein was a typical plant CDPK possesses N-terminus myristoylation site and protein kinases domain and showed the highest similarity with Arabidopsis. Thus, the gene was defined asbase on further phylogenetic analysis (Genbank accession No. MK238482).Basic protein character analysis shows that CsCDPK17 was a hydrophilic membrane-binding protein with molecularweight of 59.9?kD and PI of 5.43. Further subcellular localization assay using transientexpression in rice protoplasts and tobacco leaves proved that CsCDPK17 was localized in plasma membrane and nucleus. A series of gene transcription, light and hormone (such as ABA, SA, MeJA, etc) responding related-elements were detected in2?000?bp promoter regions. Tissue-specific expression analysis found that high expressions ofwere in the mature leaves and seeds, while the lowest transcription in roots. The transcription ofwas increased during cold acclimation and decreased during de-acclimation procedures in four cultivars with different cold resistance abilities. Moreover, stress induced expression indicated thatcould be induced by cold, drought and osmotic stresses with the highest induction levels of 5.1, 2.3 and 2.4 folds, respectively. Overall, our results suggest that the newly clonedmight be involve in the regulation of both development and abiotic stress responses (such as cold, drought and osmotic stress) in tea plants.

tea plant, CDPK gene, subcellular localization, abiotic stress, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)03-267-13

2018-11-29

2018-12-29

國(guó)家自然科學(xué)基金（31770735）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（茶葉）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)（2016C02053-4）

雷蕾，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)遺傳育種與抗逆機(jī)理研究。*通信作者：chqding@tricaas.com，xcw575@tricaas.com