鄧林 徐浩 戰(zhàn)欣 劉曉玲 高福生濰坊醫(yī)學(xué)院6053;濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科6000

煙曲霉菌是一種常見(jiàn)的霉菌,是重癥支氣管哮喘(哮喘)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[1]。研究表明,在哮喘患者中,28.5%的患者煙曲霉抗原皮膚試驗(yàn)呈陽(yáng)性,且與哮喘嚴(yán)重程度呈明顯相關(guān)。英國(guó)學(xué)者Dening首先提出了真菌致敏的嚴(yán)重哮喘的概念,之后的學(xué)者們也嘗試著總結(jié)了其特征性表現(xiàn)。先前我們的試驗(yàn)也證實(shí),煙曲霉暴露確實(shí)可以加重哮喘大鼠氣道上皮下纖維化[2],但是具體機(jī)制仍不明確。

本研究通過(guò)對(duì)雞卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏液致敏和OVA 激發(fā)液激發(fā)建立的哮喘大鼠模型,吸入煙曲霉菌分生孢子,從而研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)與氣道重塑之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 煙曲霉菌株(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院細(xì)菌室),OVA 干粉(solarbio,中國(guó)北京索來(lái)寶科技有限公司),氫氧化鋁(中國(guó)天津博迪化工股份有限公司),SB-431542(中國(guó)上海前塵生物科技有限公司),Anti-TGF-β1抗體(美國(guó)abcam),Tris-EDTA 抗原修復(fù)液、抗鼠/兔通用型免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(美國(guó)proteintech),TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(中國(guó)上海伊萊瑞特生物科技有限公司),Masson三色染色試劑盒(中國(guó)北京索萊寶有限公司),霧化器(boy037G 600型,pari德國(guó)),霧化箱(自制,密閉有機(jī)玻璃50 cm×27 cm×25 cm)。

1.2 制備煙曲霉菌孢子懸液、致敏液、霧化液取自于侵襲性肺曲霉菌病患者的一株煙曲霉。將煙曲霉在37 ℃的沙氏瓊脂平板培養(yǎng)基上培育2 周。參考文獻(xiàn)[2]的方法,制得分生孢子懸液,離心濃縮后,用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整分生孢子濃度,每1 ml生理鹽水中含有1×105的分生孢子。致敏液：1 mg OVA+100 mg氫氧化鋁+1 ml生理鹽水混懸液,現(xiàn)用現(xiàn)配。霧化液：OVA 50 mg溶于注射用水5 ml,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取健康清潔型的雄性wistar大鼠共32只,由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(魯)20140007],4～5 周齡,體質(zhì)量140～170 g。本研究符合 《赫爾辛基宣言》的原則。在濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房飼養(yǎng),室溫26 ℃,濕度50%,模擬晝夜燈光分別為12 h,標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水。隨機(jī)分為4組,每組8只。Ⅰ組(哮喘組)：用致敏液致敏、霧化液激發(fā)的方式建立哮喘大鼠模型,致敏,在第1天、第8天,在大鼠兩腹股溝、腹和前肢皮下注射致敏液,每點(diǎn)0.2 ml,腹腔注射0.2 ml；霧化,在第15、18、21天,將大鼠放置于自制密閉有機(jī)玻璃箱(50 cm×27 cm×25 cm)內(nèi),連接霧化器,用霧化液進(jìn)行霧化吸入激發(fā),每周3次,每次30 min。Ⅱ組(哮喘+煙曲霉孢子吸入組)：用致敏液致敏、霧化液激發(fā)的方式建立哮喘大鼠模型,在第23、26、30、33、37、40 天,經(jīng)鼻滴入煙曲霉菌分生孢子懸液100μl,用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠,經(jīng)鼻滴入100μl煙曲霉孢子懸液,每側(cè)鼻孔滴入50μl,維持垂直體位10 min。Ⅲ組(哮喘+生理鹽水吸入組)：用致敏液致敏、霧化液激發(fā)的方式建立哮喘大鼠模型,在第23、26、30、33、37、40天,經(jīng)鼻滴入0.9%生理鹽水100μl。Ⅳ組(哮喘+煙曲霉孢子吸入+TGF-β1 抑制劑滴鼻組)：用致敏液致敏、霧化液激發(fā)的方式建立哮喘大鼠模型,在第23、26、30、33、37、40天,經(jīng)鼻吸入煙曲霉菌分生孢子懸液100μl,在每次分生孢子懸液吸入1 h 之前經(jīng)鼻給予14 mg/L 的SB-431542 0.5 ml。SB-433542的劑量參考文獻(xiàn)[3],后在本實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始之前經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)所得。

1.4 手術(shù)與取材 各組大鼠于最后一次經(jīng)鼻吸入煙曲霉孢子后24 h處死。取右肺上葉液氮中保存待用,將右肺下葉置于10%甲醛中固定72 h,常規(guī)脫水、石蠟包埋,5μm 厚切片,進(jìn)行 HE 及Masson三色(Masson trichrome)染色。經(jīng)氣管插管行左肺支氣管肺泡灌洗,回收的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)經(jīng)離心后,上清液-80 ℃保存。

1.5 ELISA ELISA 法測(cè)定BALF 上清液中TGF-β1 含量,取出 BALF 上清液,室溫孵育20 min,根據(jù)ELISA 試劑盒操作說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔光密度(A)值。

1.6 肺組織中TGF-β1免疫組織化學(xué)染色 取已經(jīng)包埋好的大鼠肺組織石蠟塊切片,脫蠟入水,制作組織切片。選取兔抗鼠TGF-β1單克隆抗體,工作濃度為1∶500,選取抗鼠/兔通用型二抗,DAB染色,HE復(fù)染,用中性樹(shù)脂封存切片。陽(yáng)性結(jié)果為支氣管周?chē)?xì)胞外基質(zhì),特別在氣道網(wǎng)狀基底膜區(qū)域、固有層以及黏膜下層出現(xiàn)黃色或棕黃色的顆粒。每只大鼠隨機(jī)選取5個(gè)直徑在500～1 000μm的細(xì)支氣管區(qū),應(yīng)用Image Pro-Plus software 6.0軟件計(jì)算陽(yáng)性結(jié)果信號(hào)累積光密度。以TGF-β1染色陽(yáng)性的IOD 表示TGF-β1表達(dá)水平。

1.7 肺組織HE染色、Masson染色 按照HE染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色。陽(yáng)性結(jié)果為胞漿呈淡紅色,胞核呈藍(lán)黑色。在HE染色切片上,Olympus顯微鏡下放大200 倍,CCD 數(shù)字相機(jī)采集圖像,各只大鼠均于直徑500～1 000μm 的細(xì)支氣管區(qū)中取像,隨機(jī)選取5個(gè)視野,測(cè)量支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度。

按照Masson染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色。陽(yáng)性結(jié)果為膠原纖維呈藍(lán)色,細(xì)胞核呈黑藍(lán)色。在Masson染色切片上,與上述方法一致,測(cè)量氣道上皮基底膜下20μm 區(qū)域內(nèi)被染成藍(lán)色的非細(xì)胞部分的面積和該區(qū)域的總面積,以被染成藍(lán)色部分的面積占該區(qū)域總面積的百分比表示上皮下膠原纖維沉積的程度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,定量資料以表示。2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組間均數(shù)檢測(cè)采用SNK 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BALF 上清液中 TGF-β1含量 Ⅱ 組 BALF中TGF-β1的含量[(85.06±14.30)μg/L]與Ⅲ組BALF中TGF-β1的含量[(38.90±8.31)μg/L]相比,TGF-β1水平明顯升高(t=7.89,P＜0.01)。Ⅰ組BALF中TGF-β1 的含量[(33.21±5.14)μg/L]與Ⅲ組相比,TGF-β1水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.64,P＞0.05)。Ⅳ組BALF中TGF-β1的含量[(65.85±11.32)μg/L]與Ⅱ組相 比,TGF-β1水平降低(t=2.98,P＜0.05)。

2.2 肺組織中TGF-β1免疫組織化學(xué)染色 Ⅱ組肺組織中TGF-β1 的表達(dá)(IOD 為2.13±0.15)與Ⅲ組肺組織中TGF-β1的表達(dá)相比(IOD 為0.90±0.07),TGF-β1表達(dá)明顯升高(t=21.06,P＜0.05)。Ⅳ組肺組織中 TGF-β1的表達(dá)(IOD 為1.68±0.15)較Ⅱ組TGF-β1表達(dá)明顯降低(t=5.90,P＜0.05)。Ⅰ組肺組織中 TGF-β1 的表達(dá)(IOD 為0.82±0.01)與Ⅲ組相比,TGF-β1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.40,P＞0.05)(圖1、2)。

圖1 各組大鼠肺組織TGF-β1 表達(dá)病理學(xué)觀察 HE ×200 A：哮喘組；B：哮喘+煙曲霉孢子吸入組；C：哮喘+生理鹽水吸入組；D：哮喘+煙曲霉孢子吸入+TGF-β1 抑制劑滴鼻組

2.3 肺組織中HE 染色、Masson 染色 肺組織HE染色觀察大鼠氣道壁及平滑肌增厚情況。肺組織Masson染色觀察大鼠氣道上皮下膠原纖維沉積情況。Ⅱ組HE 染色為紅色的支氣管壁厚度[(17.39±2.89)μm2/μm]、支氣管平滑肌厚度[(12.21±2.50)μm2/μm]與Ⅲ組支氣管壁厚度[(8.67±1.48)μm2/μm]、支氣管平滑肌厚度[(5.06±1.78)μm2/μm]相比,明顯增厚(t=7.60、6.58,P值均＜0.05)。染色為藍(lán)色的膠原纖維Ⅱ組上皮下膠原沉積[Masson trichrome藍(lán)染面積/基底膜下 20 μm 區(qū)域面積為(42.52±7.34)%]與Ⅲ組上皮下膠原沉積[Masson trichrome藍(lán)染面積/基底膜下20μm 區(qū)域面積為(16.92±3.11)%]相比,明顯沉積(t=9.14,P＜0.05)。

圖2 各組大鼠肺組織TGF-β1 表達(dá)形態(tài)學(xué)分析

圖3 各組大鼠氣道壁、平滑肌增厚病理學(xué)觀察 HE ×200 A：哮喘組；B：哮喘+煙曲霉孢子吸入組；C：哮喘+生理鹽水吸入組；D：哮喘+煙曲霉孢子吸入+TGF-β1 抑制劑滴鼻組

Ⅳ組支氣管壁厚度[(9.92±1.32)μm2/μm]、支氣管平滑肌厚度[(5.21±3.01)μm2/μm]與Ⅱ組相比,未見(jiàn)明顯增厚(t=6.64、5.06,P值均＜0.05)。Ⅳ組上皮下膠原沉積[Masson trichrome藍(lán)染面積/基底膜下20μm 區(qū)域面積為(19.03±6.88)%]與Ⅱ組相比,膠原纖維未見(jiàn)明顯沉積(t=6.58,P＜0.05)。Ⅰ組大鼠支氣管壁厚度[(7.61±1.18)μm2/μm]、支氣管平滑肌厚度[(4.16±1.59)μm2/μm]與Ⅲ組相比,氣道壁增厚差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.59、-1.07,P＞0.05),Ⅰ組上皮下膠原沉積[Masson trichrome藍(lán)染面積/基底膜下20μm區(qū)域面積為(14.15±3.08)%]與Ⅲ組相比,膠原纖維沉積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.42,P＞0.05)(圖3～7)。

圖4 各組大鼠氣道壁增厚形態(tài)學(xué)分析

3 討論

煙曲霉菌,在室內(nèi)環(huán)境和糧食粉塵中廣泛存在。由于其體積小(直徑為2～3μm)和疏水性,可能會(huì)懸浮在空氣中很長(zhǎng)一段時(shí)間,因此增加了吸入人肺泡組織中的可能性,但是卻只有在部分易感人群中才會(huì)導(dǎo)致一系列疾病[4-5]。研究證實(shí),煙曲霉菌孢子長(zhǎng)期吸入與哮喘患者呼吸道癥狀密切相關(guān)[6],但是最常見(jiàn)的表現(xiàn)形式是哮喘患者對(duì)煙曲霉菌的超敏反應(yīng),它是ABPA 發(fā)展的第一步,當(dāng)然只有少部分煙曲霉菌超敏反應(yīng)的患者發(fā)展為ABPA[1]。

圖5 各組大鼠氣道平滑肌增厚形態(tài)學(xué)分析

圖6 各組大鼠氣道上皮下膠原纖維沉積病理學(xué)觀察 HE ×200 A：哮喘組；B：哮喘+煙曲霉孢子吸入組；C：哮喘+生理鹽水吸入組；D：哮喘+煙曲霉孢子吸入+TGF-β1 抑制劑滴鼻組

圖7 各組大鼠氣道上皮下膠原纖維沉積形態(tài)學(xué)分析

我們前期的研究[2,7]發(fā)現(xiàn)煙曲霉暴露可以加重哮喘大鼠的Th2型氣道炎癥,促進(jìn)氣道上皮下纖維化,從而增加氣道反應(yīng)性。并且煙曲霉暴露對(duì)哮喘大鼠的影響不依賴于煙曲霉在氣道的定植。

煙曲霉菌暴露加重哮喘氣道重塑的機(jī)制目前尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn),哮喘大鼠給予慢性煙曲霉菌暴露后,無(wú)論在BALF中TGF-β1的含量還是肺組織免疫組織化學(xué)中TGF-β1的表達(dá)均明顯增加,同時(shí),HE染色提示支氣管管壁增厚,支氣管平滑肌增厚,Masson染色顯示支氣管上皮組織下膠原沉積進(jìn)一步加重(t=7.60、6.58、9.14、7.89、21.06,P值均＜0.05)。而在哮喘大鼠慢性煙曲霉暴露后給予 TGF-β1 抑制劑處理,TGF-β1 表達(dá)明顯減低,同時(shí)支氣管管壁增厚程度、支氣管平滑肌增厚程度及支氣管上皮組織下膠原沉積的程度均明顯減輕(t=6.64、5.06、6.58、2.98、5.90,P值均＜0.05)。結(jié)果提示吸入慢性煙曲霉暴露,可能通過(guò)增加TGF-β1表達(dá)的方式,促進(jìn)氣道管壁增厚、支氣管平滑肌增厚、上皮組織下膠原沉積,表現(xiàn)為肺組織纖維化程度增加,從而加重氣道重塑。

相關(guān)研究也進(jìn)一步證實(shí)了這點(diǎn)。多項(xiàng)研究證實(shí)[8-10],TGF-β1/Smad信號(hào)通路與纖維化程序的啟動(dòng)相關(guān),而Stumm 等[11]證實(shí)了其在哮喘氣道重塑形成的過(guò)程中同樣發(fā)揮重要的作用。在對(duì)慢性哮喘發(fā)病機(jī)制的研究中,樸紅梅和宋秋紅[3]得出了如下結(jié)論：TGF-β 受體抑制劑可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制TGF-β 與受體的結(jié)合,進(jìn)而抑制其下游因子CTGF m RNA 和膠原α1m RNA 的表達(dá),延緩或改善氣道重塑。同時(shí)約1/3到1/2的重度哮喘患者存在對(duì)曲霉菌的過(guò)敏[12]。哮喘時(shí)氣道微環(huán)境的改變有利于煙曲霉孢子在呼吸道黏膜的黏附滯留,而煙曲霉菌在肺內(nèi)的長(zhǎng)時(shí)間停留,是氣道炎癥和氣道纖維化的原因[13]。而且越來(lái)越多的證據(jù)表明真菌過(guò)敏與重癥哮喘表型有關(guān),即真菌致敏的重癥哮喘。如果不及時(shí)治療,氣道纖維化會(huì)導(dǎo)致肺功能的逐漸喪失[12],而且現(xiàn)在基于真菌致敏的重癥哮喘的抗真菌治療的相關(guān)研究也很少[14]。

總之,本研究利用OVA 致敏激發(fā)液激發(fā)建立的哮喘大鼠模型,然后給予慢性煙曲霉暴露,并同時(shí)給予 TGF-β1 抑制劑處理,結(jié)果顯示TGF-β1 抑制劑可以抑制煙曲霉菌暴露所致的氣道重塑。本研究結(jié)果提示TGF-β1可能參與了慢性煙曲霉暴露所致哮喘的氣道重塑,其確切的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突