王曉燕 江 波 張 濤

（江南大學國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20），可從麥芽低聚糖、異麥芽糖、α-葡聚糖等底物的非還原末端釋放α-葡萄糖，或通過轉糖基作用將葡萄糖基從底物轉移至受體形成相應非發(fā)酵性的低聚糖或糖脂、糖肽等。在自然界中分布廣泛，種類繁多，幾乎在所有的生命體中皆有發(fā)現。根據氨基酸分類系統(tǒng)，α-葡萄糖苷酶分屬于5 個糖苷水解酶家族：GH4，GH13，GH31，GH63 和GH97，大多α-葡萄糖苷酶均屬于GH13 和GH31 家族。α-葡萄糖苷酶的應用研究主要集中在制備低聚異麥芽糖等方面，近年來，隨著對α-1,3 糖苷鍵具有高度選擇性的α-葡萄糖苷酶的發(fā)現，有報道表明可利用α-葡萄糖苷酶催化麥芽低聚糖等制備黑曲霉低聚糖（Nigerooligosaccharides，NOS）。

黑曲霉低聚糖是一類分子中含有α-1,3 糖苷鍵的新型功能性低聚糖，主要包括黑曲霉糖（Nigerose）、黑曲霉糖基葡萄糖（Nigerosylglucose，NOG）和黑曲霉糖基麥芽低聚糖（Nigerosyl matooligosaccharides，NMS）等。黑曲霉糖天然存在于清酒、豆醬等發(fā)酵型產品中，含量較低，難以進行大規(guī)模的提取工作，而對于聚合度更高的黑曲霉低聚糖，在自然界中幾乎不存在，因此黑曲霉低聚糖的生產方法主要有化學合成、多糖水解法和糖基轉移法3 種。據報道，黑曲霉低聚糖不僅具有一般功能性低聚糖所共有的熱量低、抗齲齒、促進雙歧桿菌增殖等生理功能，還具有免疫激活、改善風味、抑制色素褪色等多種作用，可廣泛應用于醫(yī)學、食品等多個行業(yè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及質粒

細菌克隆宿主E.coli DH5α、真菌表達宿主P.pastoris GS115 均為本實驗室保藏，含有源自Acremonium sp.S4G13 α-1,3-葡萄糖苷酶基因的重組質粒pPIC9K 為委托上海捷瑞生物工程公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物10 g，胰蛋白胨5 g，NaCl 10 g；MD 培養(yǎng)基（g/L）:YNB 13.4，生物素4×10-4，葡萄糖20g，瓊脂15 g；YPD 培養(yǎng)基（g/L）:酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g；BMGY 培養(yǎng)基（g/L）:YNB 13.4 mL，生物素4×10-4，甘油30 mL，0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液；BMMY培養(yǎng)基（g/L）:YNB 13.4 mL，生物素4×10-4，甲醇0.5%，0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液。

1.1.3 主要試劑

黑曲霉低聚糖、麥芽三糖標準品，購自Sigama公司；蛋白胨、酵母粉、YNB、生物素、G418、卡那霉素，均購自上海生工生物工程公司；麥芽糖、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甘油等，均為國產分析純試劑，購自國藥集團化學試劑公司；DL 10000、15000 DNA Marker、BglⅡ限制性內切酶、4S Green Plus 無毒核酸染料，購自大連寶生物工程有限公司；質粒小量制備試劑盒，購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 主要設備及儀器

GI54DWS 高壓滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司，THZ-100 恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科技有限公司；Centrifuge 5804R 高速冷凍離心機、Authorized Thermal Cycler PCR 儀、電轉儀、電轉杯，德國Eppendorf 公司；Waters e2695 型高效液相色譜儀，美國Waters 公司；Asahipak NH2P-50 4E 氨基柱、Shodex 示差折光檢測器，日本Shodex 公司；冷凍真空干燥機，Labconco 公司。

1.3 P.pastoris GS115 重組菌的構建

1.3.1 重組質粒pPIC9K-ALG 的構建

通過NCBI 基因文庫，查找到來源于Acremonium sp.S4G13 的編碼α-葡萄糖苷酶的基因，并將此基因片段委托上海捷瑞生物工程有限公司進行合成，在該基因的5' 和3' 末端分別引入EcoR I 和Not I2 個限制性酶切位點，將基因片段連接入酵母表達載體pPIC9K，合成重組質粒pPIC9K-AGL。

1.3.2 重組質粒的轉化

重組質粒pPIC9K-agl 經使用BglⅡ快切酶線性化后，加入P.pastoris GS115 感受態(tài)細胞中以1.5 kV電壓進行電轉化。電轉液在30℃條件下經1 h～2 h孵育后涂布于MD 平板，30 ℃倒置培養(yǎng)2 d～3 d直至長出單菌落。挑選MD 平板上的單菌落依次接種至0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL的YPD-G418 平板上，30℃倒置培養(yǎng)2 d～3 d。同時轉化pPIC9K 空質粒作為對照。

1.3.3 重組菌的培養(yǎng)及誘導產酶

1.3.3.1 種子培養(yǎng)

將MD 平板上的重組酵母單菌落接種到5 mL YPD 試管培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)16 h。

1.3.3.2 擴大培養(yǎng)

以體積濃度2%的接種量將上述菌液接入裝液量為50 mL BMGY 培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.3.3 誘導培養(yǎng)

離心收集上述菌體，在無菌條件下將其全部轉接入裝液量為50 mL BMMY 培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)120 h，每24 h補加0.5%甲醇。

1.3.4 酶活測定方法及定義

將0.9 mL 的100 g/L 麥芽糖溶液與0.1 mL 的粗酶液在50 mmol/L、pH 7.0 磷酸緩沖液體系中充分混勻，55 ℃下反應12 h，沸水浴10 min 終止反應。反應液經樹脂除鹽及微孔過濾后經HPLC 檢測，用歸一化法（黑曲霉糖基葡萄糖占總糖的百分比）計算黑曲霉糖基葡萄糖的轉化率，以葡萄糖作為內標計算黑曲霉糖基葡萄糖的生成量，計算酶活。

HPLC 檢測條件：Waters e2695 型高效液相色譜儀，色譜柱AsahipakNH2P-504E（4.6mm×250mm），示差折光檢測器，流動相為乙腈∶水=75 ∶25（v/v），流速1 mL/min，柱溫30 ℃。

酶活定義：在上述反應條件下，每小時生成1 μmol 的黑曲霉糖基葡萄糖所需酶量為一個酶活單位（1 U）。

1.4 重組P.pastoris GS115 產酶條件的優(yōu)化

1.4.1 接種量對重組P.pastoris GS115 生長階段的影響

重組菌活化后，分別以1%、3%、6%、10%、15%的接種量接入50 mL/250 mL BMGY 培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)，每隔3 h 取樣，測定OD600監(jiān)測重組菌的生長狀況。

1.4.2 碳源對重組P.pastoris GS115 生長階段的影響

重組菌活化后，以10%的接種量分別接種至甘油比例為1%、2%、3%、4%、5%的50 mL/250 mL BMGY 培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)，每隔3 h取樣，測定OD600 監(jiān)測重組菌的生長狀況。

1.4.3 初始pH 對重組P.pastoris GS115 生長階段的影響

重組菌活化后，以10%的接種量分別接種到pH 值為5.0、6.0、7.0、8.0 的50 mL/250 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)，每隔3 h 取樣，測定OD600 監(jiān)測重組菌的生長狀況。

1.4.4 初始甲醇體積濃度對重組P.pastoris GS115 誘導階段的影響

無菌條件下，將BMGY 培養(yǎng)基中的全部菌體轉接入50 mL/250 mL BMMY 培養(yǎng)基中，初始甲醇體積濃度分別為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)，24 h 后取樣，測定酶活和菌體干重。

1.4.5 補加甲醇量對重組P.pastoris GS115 誘導階段的影響

無菌條件下，將BMGY 培養(yǎng)基中的全部菌體轉接入甲醇初始體積濃度為1%的50 mL/250 mL BMMY 培養(yǎng)基中，每隔24 h 分別補加比例為0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的100%甲醇，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)，每隔24 h 取樣，測定酶活和菌體干重。

1.4.6 裝液量對重組P.pastoris GS115 誘導階段的影響

無菌條件下，將BMGY 培養(yǎng)基中的全部菌體轉接入裝液量分別10%、20%、30%、40%（250 mL錐形瓶計）的BMMY 培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每隔24 h 取樣，測定酶活和菌體干重。

1.4.7 誘導溫度對重組P.pastoris GS115 誘導階段的影響

無菌條件下，將BMGY 培養(yǎng)基中的全部菌體轉接入裝液量為20%的BMMY 培養(yǎng)基中，分別在25 ℃、28 ℃、30 ℃條件下誘導，每隔24 h 取樣，測定酶活和菌體干重。

1.4.8 山梨醇添加量對重組P.pastoris GS115 誘導階段的影響

無菌條件下，將BMGY 培養(yǎng)基中的全部菌體轉接入山梨醇添加量分別為3 g/L、6 g/L、9 g/L、12 g/L 的BMMY 培養(yǎng)基中，25 ℃條件下誘導，培養(yǎng)144 h 后取樣，測定酶活和菌體干重。

2 結果與分析

2.1 高拷貝轉化菌P.pastoris GS115 的篩選

首先通過不含組氨酸的基本培養(yǎng)基MD 對轉化子進行初篩，未轉化的宿主P.pastoris GS115 在組氨酸脫氫酶位點（His4）有突變，不能在此平板上生長，只有整合成功的重組P.pastoris GS115 才能在MD 平板上生長。

為提高篩選效率，得到高拷貝轉化子，通過YPD-G418 平板進行復篩。收集MD 平板上的陽性轉化子，依次經0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL 的G418 平板進行梯度篩選。

經過多次轉化試驗后，分別從2.0 mg/mL、3.0 mg/mL 的G418 抗性平板上挑取20 個轉化子，依次編 碼 為PKAGL-2-1～PKAGL-2-20，PKAGL-3-1～PKAGL-3-20?；罨筮M行搖床誘導培養(yǎng)，96 h 后取樣進行酶反應：以100 g/L 麥芽糖（50 mmol/L，pH 7.0 的磷酸緩沖液配制）為底物在45 ℃反應6 h，沸水浴10 min 滅酶。經HPLC 進樣檢測后，因產物黑曲霉糖轉化率較低，難以進行準確定量，而在前期反應階段中，黑曲霉糖的轉化率與葡萄糖的轉化率呈正相關，因此可簡單的以體系中檢測到的葡萄糖轉化率作為篩選高拷貝轉化子的相對指標，結果如下頁表1 所示，選擇菌株PKAGL3-14繼續(xù)進行后續(xù)試驗。

2.2 重組P.pastoris GS115 產酶條件的研究

畢赤酵母的發(fā)酵采取分階段培養(yǎng)，第一階段以甘油為碳源，主要目的是促進菌體生長，實現菌體大量增殖，為后期發(fā)酵階段做準備，根據Invitrogen的畢赤酵母操作手冊，這一階段培養(yǎng)溫度一般設為30 ℃，無需優(yōu)化，但其他影響因素例如接種量、碳源濃度、初始pH 等對菌體生長的影響需要做進一步的研究；第二階段是甲醇誘導表達階段，此過程中，初始甲醇體積濃度、甲醇補加量、誘導溫度、轉接量、多碳源補充等因素均會對畢赤酵母的生長和發(fā)酵產生不同程度的影響，需要逐一進行研究。

表1 AGL 基因高拷貝重組畢赤酵母的篩選

培養(yǎng)前期篩選的高拷貝轉化子PKAGL3-14，定時取樣測定酶活和菌體生長量，繪制該重組菌生長階段的生長曲線和誘導階段的發(fā)酵曲線，見圖1。由圖1 可知，該重組菌的發(fā)酵周期較長，在轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基的前2 天，菌體處于適應階段，產酶量為0，之后隨著發(fā)酵時間延長，酶活逐漸增加，在第7 天達到最高值1.22 U/mL。

圖1 重組菌生長及發(fā)酵曲線

2.2.1 接種量對重組P.pastoris GS115 生長的影響

對于一個特定的生長周期，接種量過小會延緩菌株到達對數期的時間，從而延長整個發(fā)酵周期，過大的接種量則會在短時間內消耗掉培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分。不同接種量對重組畢赤酵母生長的影響結果見下頁圖2。

由圖2 可知，培養(yǎng)前2 h，菌體生長緩慢，處于延滯期；12 h～30 h 期間，生長速度均持續(xù)加快，處于指數增長階段，該階段的菌體適宜于轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)；30 h 過后，1%、3%、6%接種量菌體生長速度仍處于對數增長期，10%、15%接種量的菌體生長增速減緩，即將過渡到穩(wěn)定期。因此，選取10%為最適接種量。

2.2.2 甘油含量對重組P.pastoris GS115 生長的影響

圖2 不同接種量對重組畢赤酵母生長的影響

碳是微生物正常生命活動所必需的元素，能為微生物生長提供碳元素的營養(yǎng)物質均稱為碳源，一方面，碳源可以為微生物的碳架構建以及細胞生長提供碳成分，另一方面，也可以為微生物的生命活動提供能量。

甘油作為酵母生長階段的唯一碳源，是影響菌體生長的關鍵因素。將重組菌接種至甘油含量不同的BMMY 培養(yǎng)基中，每隔3 h 取樣檢測該重組菌的生長狀況，測定結果見圖3。

圖3 不同甘油濃度對重組畢赤酵母生長的影響

由圖3 可知，在開始階段，甘油消耗較少，不同含量均能滿足菌體生長的需要，因此對菌體量影響較小，之后隨著時間延長，差異逐漸明顯。甘油含量1%的培養(yǎng)基中菌體生長速度最慢，也最早進入平緩期，說明少量的甘油被快速消耗，后期已不能滿足菌體生長需要；含量3%的培養(yǎng)基中菌體生長速度最快，甘油含量2%、4%、5%的培養(yǎng)基中菌體生長趨勢差別不大，說明過高的碳源含量一方面會對菌體造成負擔，延緩它的生長趨勢，另一方面也會增加經濟成本，因此，選取3%為最適甘油含量。

2.2.3 初始pH 值對重組P.pastoris GS115 生長的影響

微生物所處環(huán)境的酸堿度對其生長和繁殖有很大的影響，一方面，pH 可以通過激活或抑制某些特定酶的活性從而改變菌體的代謝途徑，進而影響到菌體的生長；另一方面，pH 值可以通過改變細胞膜表面所帶電荷的狀態(tài)從而改變細胞膜的通透性，進而影響到菌體對營養(yǎng)物質的吸收利用以及代謝產物的排放等；此外，pH 還可以通過改變溶液中某些物質的離子化程度進而影響到菌體對該物質的吸收。

重組畢赤酵母菌在初始pH 值不同的BMMY 培養(yǎng)基中生長狀況如圖4 所示。

圖4 初始pH 值對重組畢赤酵母生長的影響

由圖4 可知，當初始pH 值為6.0 時，菌體生長狀態(tài)最好，pH 5.0 和7.0 條件下對菌體生長狀況影響較小，菌體生長量略有下降，但偏堿性環(huán)境（pH 8.0 和9.0）不適于菌體生長，生長量大幅度下降，說明菌體更偏好在弱酸性環(huán)境中生長，因此，選擇pH 6.0 為重組畢赤酵母生長階段的初始pH值。

通過對畢赤酵母生長階段影響因素的研究，確定了最佳的生長階段培養(yǎng)條件為：接種量10%，碳源（甘油）含量3%，初始pH 值6.0。為進一步確定合適轉接到誘導培養(yǎng)基BMMY 的種齡，在上述最優(yōu)培養(yǎng)條件下，測定了菌體在BMGY 培養(yǎng)基中的生長曲線，如圖5 所示。

圖5 重組畢赤酵母的生長曲線

由圖5 可知，在發(fā)酵前6 h，菌體生長較慢，沒有明顯增長，為延滯期；6～24 h 期間，菌體生長迅速，呈指數增長，為對數期；24 h 以后，菌體量基本維持恒定，菌體生長進入了穩(wěn)定期。因此，選取培養(yǎng)24 h 的菌體轉接入后續(xù)BMMY 培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。

2.2.4 初始甲醇體積濃度對重組P.pastoris GS115 產酶的影響

在畢赤酵母的發(fā)酵過程中，甲醇既是碳源又是誘導劑，當菌體由生長階段過渡到發(fā)酵階段時，需要對含有甲醇的生長環(huán)境進行適應，因此，確定合適的甲醇初始體積濃度至關重要，過低會使菌體處于饑餓狀態(tài)，延緩菌體的生長，不能達到足夠的誘導效果，過高會對菌體產生毒害作用，抑制醇氧化酶的活性從而影響目的蛋白的表達甚至使菌體死亡。

初始甲酵體積濃度對α-葡萄糖苷酶的影響見圖6。

圖6 初始甲醇濃度對產α-葡萄糖苷酶的影響

圖6 反映了在甲醇初始濃度不同的BMMY 培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌24 h 后的產酶情況，初始甲醇體積濃度1%的條件下，發(fā)酵24 h 酶活為2.912 U/mL，之后隨著甲醇體積濃度的升高而降低，當甲醇體積濃度為5%時，酶活已降低了42%，但菌體量之間差異不超過10%，說明在誘導開始階段，菌體還處于適應期，1%的甲醇已能滿足生長和發(fā)酵產酶的需要，過高反而會影響目的蛋白的表達，因此，甲醇初始體積濃度選定為1%。

2.2.5 補加甲醇量對重組P.pastorisGS115 產酶的影響

隨著發(fā)酵的持續(xù)進行，初始添加的甲醇被不斷消耗，因此需要每隔24 h 補加一定量的甲醇，當補加量在0.25%～2.5%范圍內時，結果如圖7 所示。當補加甲醇量為0.5%時，發(fā)酵96 h 酶活達到最高4.301 U/mL，補加量低于0.5%時，甲醇無法同時完全滿足菌體生長和誘導產酶的需求量，因此，雖然變化趨勢相同，但所能達到的最高酶活有所差異，當甲醇體積濃度高于0.5%時，會在更短的時間內達到產酶的最大值，但由于過剩甲醇對于菌體的損傷作用，反而影響了目的蛋白的表達。

圖7 不同濃度甲醇補加量對產α-葡萄糖苷酶的影響

2.2.6 裝液量對重組P.pastoris GS115 產酶的影響

在搖瓶培養(yǎng)中，不同體積的裝液量會導致溶氧水平的差異，裝液量越少，傳氧系數越大。重組畢赤酵母的發(fā)酵過程需要足夠的氧氣激活體內的過氧化氫酶體，進而誘導外源重組蛋白的表達，本試驗研究了不同裝液量條件下對菌體產酶的影響，結果如圖8 所示，氧氣含量對重組菌發(fā)酵酶活有顯著的影響，裝液量逐漸加大時培養(yǎng)基中氧氣含量逐漸減少，菌體產酶效率降低，裝液量小于20%時，菌體產酶較少，可能是因為菌體將大部分能量用于自身繁殖所致。裝液量大于20%時，氧氣含量不足，菌體生長與繁殖受到影響，產酶效率也很低；當裝液量為20%時，發(fā)酵酶活達到最高，為4.442 U/mL。因此，選取20%的裝液量為最適裝液量。

圖8 裝液量對產α-葡萄糖苷酶的影響

2.2.7 誘導溫度對重組P.pastoris GS115 產酶的影響

相較于最適生長溫度30 ℃，已有多項研究表明，低溫有利于酵母重組外源蛋白的分泌表達，低溫對其產酶的影響主要分為幾個方面：減輕甲醇對細胞的損傷作用，增加細胞存活率；延長目的蛋白在內質網中的滯留時間，使得到更好的加工從而增加目的蛋白的正確折疊率；降低胞內蛋白的活性，減少對目的蛋白的降解；促進畢赤酵母自身的物質和能量代謝，提高目的蛋白的表達速率；提高了胞內AOX 基因的活性，進而增加了甲醇的代謝速率，提升了目的蛋白的表達效率。

圖9 溫度對產α-葡萄糖苷酶的影響

為提升目的蛋白的表達效率，本試驗設置了25 ℃、28 ℃、30 ℃3 個梯度進行誘導表達，結果如圖9 所示。溫度的降低雖然延長了發(fā)酵過程中到達最高酶活的時間，但同時也提升了外源蛋白的表達效率，在25 ℃條件下誘導120 h，酶活達到最高值4.782 U/mL。此外，28 ℃條件下的產酶效果與25 ℃相比沒有明顯區(qū)別，因此若應用于工業(yè)生產，為降低成本，只需適當降低溫度即可。

2.2.8 山梨醇添加量對重組P.pastoris GS115 產酶的影響

在畢赤酵母誘導階段，甲醇同時作為碳源和誘導劑，使得誘導階段酵母菌生長速率較低，因此可以考慮采用復合碳源的方式提高菌體生長速度，加快產酶速率。據報道，對于Muts 型重組子，山梨醇不會對AOX 基因造成抑制，不會抑制醇氧化酶的表達，可用作甲醇誘導期的共同碳源，促進畢赤酵母的生長，提高細胞活力，增強甲醇誘導的效果，減輕甲醇以及代謝中有毒副產物對菌體的毒性作用，最終達到促進外源蛋白表達的目的。

山梨醇添加量對產α-葡萄糖苷酶的影響見圖10。

圖10 山梨醇添加量對產α-葡萄糖苷酶的影響

由圖10 可知，向誘導培養(yǎng)基中添加不同量的山梨醇，均可以提升發(fā)酵液中重組α-葡萄糖苷酶的表達量，當添加量為6 g/L 時，重組α-葡萄糖苷酶酶活達到最高值7.80 U/mL，但當進一步加大山梨醇的添加量時，過多的山梨醇使得發(fā)酵液的滲透壓上升，阻礙了菌體的正常生長與代謝產酶，使得酶活下降。因此，山梨醇的最適添加量為6 g/L。

3 結論

本研究實現了重組α-1,3-葡萄糖苷酶的畢赤酵母胞外表達，與其他表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達系統(tǒng)具有自身表達蛋白簡單、操作簡便以及遺傳穩(wěn)定等特性。此外，通過單因素試驗對培養(yǎng)過程中接種量、碳源濃度、初始pH、培養(yǎng)溫度以及誘導過程中初始甲醇添加量、甲醇補加量、誘導溫度、裝液量等條件進行了優(yōu)化，上清液中α-1,3-葡萄糖苷酶酶活由1.22 U/mL 提升至7.8 U/mL，提升了5.4 倍。目前關于α-1,3-葡萄糖苷酶的工程菌表達的報道還比較少，本試驗為相關方面的研究提供了一定的數據。