陳 濤，馬立霞，李志鑫，曾勇慶*，陳 偉*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安 271018；2.山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，山東泰安 271018）

脂肪組織主要由脂肪細胞組成，是哺乳動物機體中發(fā)育最晚的組織。皮下脂肪位于肌肉和真皮之間，肌內(nèi)脂肪位于肌束和肌纖維之間，兩者生長發(fā)育環(huán)境不同，因此探究肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪形成的規(guī)律和機制可以增加對脂肪沉積機制的認識[1]。前體脂肪細胞在經(jīng)歷細胞形態(tài)學(xué)和順序激活C/EBPα、C/EBPβ 和PPARγ 等基因后，最終分化為成熟脂肪細胞，始終存在于動物體內(nèi)，負責(zé)脂肪的生成。

前體脂肪細胞是研究脂類代謝調(diào)節(jié)及多種疾病的基礎(chǔ)，還可作為脂肪沉積的重要研究對象[2]。但是目前成熟的細胞系只有3T3-L1、3T3-F442A 及ob17 等。在大多數(shù)物種上都沒有細胞系，只能通過原代培養(yǎng)的方法獲取，而且一般只能在傳代十代以內(nèi)可以誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細胞。目前，在國內(nèi)外對于前體脂肪細胞的研究中，已在人、大鼠、豬及牛等動物上建立了比較成熟的細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)體系。因此，前體脂肪細胞相比其他細胞系而言，相對較難于培養(yǎng)。

新西蘭兔是重要的模式動物，其前體脂肪細胞可作為人類肥胖、胰島素抵抗以及眾多心血管疾病的發(fā)病機理研究的基礎(chǔ)[3]。因此，本研究擬建立新西蘭兔的肌內(nèi)和皮下脂肪的前體脂肪細胞培養(yǎng)體系，并且探討其誘導(dǎo)分化的規(guī)律，為研究新西蘭兔脂肪形成以及脂質(zhì)沉積的機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 實驗材料 8 只1 日齡新西蘭兔購于泰山種兔場（中國泰安）。

1.2 實驗試劑 DMEM/F12 培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰酶、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）均購于Gibco 公司（美國）。青鏈霉素混合液、紅細胞裂解液、胰島素（Insulin，INS）、地塞米松（Dexamethasone，Dex）、3-異丁基-1- 甲基黃嘌呤（3-Isobutyl-1-Methylxanthine，IBMX）、油紅O 染料、二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、膠原酶Ⅰ和膠原酶Ⅱ均購于北京索萊寶科技有限公司（中國北京）。反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和熒光定量試劑盒TB Green? Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）購于TaKaRa（日本）。Cell Counting Kit-8 購于碧云天生物技術(shù)有限公司（中國上海）。RNAE.Z.N.A.?DNA/RNA Isolation Kit 提取試劑盒購于Omega Bio-Tek（美國）。

1.3 培養(yǎng)基及主要試劑的配制 高濃度的青鏈霉素混合液：1.5 mL 青鏈霉素混合液加入到50 mL PBS 中配成青鏈霉素（300 IU/mL）。膠原酶Ⅰ和膠原酶Ⅱ分別用100 mL PBS 配制成1 mg/mL。完全培養(yǎng)液：10%胎牛血清+100 IU/mL 青鏈霉素+DMEM/F12；誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：1 μmol/L DEX+5 mg/mL INS+0.5 mmol/L IBMX+DMEM/F12+10% FBS+100 IU/mL 青鏈霉素。維持分化培養(yǎng)基：5 mg/L INS+DMEM/F12+10% FBS+100 IU/mL 青鏈霉素。油紅O 染色液：1 g 油紅O 加入100 mL 異丙醇，使用時以油紅O 飽和液加2 份蒸餾水。上述所有溶液均經(jīng)過0.22 μm 微孔濾膜過濾。

1.4 實驗方法

1.4.1 前體脂肪細胞的原代培養(yǎng) 將1 日齡新西蘭兔斷頸法處死，放入加滿酒精的大燒杯中消毒，帶入細胞間放在超凈臺中解剖，分別獲取背最長肌和皮下脂肪并放入提前配好的高濃度的青鏈霉素混合液中。用眼科剪將組織剪成體積約1 mm3的組織塊，轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中，肌肉中加入3～10 倍體積的膠原酶Ⅱ，脂肪中加入3～10 倍體積的膠原酶Ⅰ[4]。將離心管置于37℃培養(yǎng)箱70～100 min，每隔10 min 晃動1 次離心管促進組織解離。然后，用100 μm 濾網(wǎng)膜分別過濾離心管內(nèi)的液體，然后200 ×g 離心10 min，棄上清液后加入等體積的紅細胞裂解液，室溫下放置15～20 min，再經(jīng)200 ×g 離心10 min，去除上清液，通過臺盼藍計數(shù)后以1×105個/mL 的細胞密度接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中。以37℃、5% 的CO2的條件下開始啟動前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)。24 h 后換液去除未貼壁的細胞，之后每2 d 換1 次培養(yǎng)基。

1.4.2 繪制細胞生長曲線 將第2 代生長良好的2 種前體脂肪細胞分別以3×104個/mL 的密度接種到96 板，每孔加入100 μL 完全培養(yǎng)基。分別從第0 天到第12 天，每孔加入10 μL CCK8 試劑，37℃下培養(yǎng)2 h，然后分別用酶標(biāo)儀（Promega，美國）檢測細胞在450 nm 下的OD 值，計算平均值，通過所得到的值得出2 種組織分離出來的前體脂肪細胞的生長曲線。

1.4.3 前體脂肪細胞的誘導(dǎo)分化 細胞生長至80%～90%時，加入分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h 后，再更換分化維持培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，2 d 換1 次培養(yǎng)基，培養(yǎng)到第8 天形成明顯脂滴，通過油紅O 染色，顯微鏡下觀察，驗證是否誘導(dǎo)成功。

1.4.4 油紅O 染色法檢測細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量 將2 種細胞接種到96 孔板，分別在2、4、6、8、10、12 d，油紅O 染色后拍照，然后通過油紅O 染色提取法，通過異丙醇將細胞內(nèi)的油紅O 重新萃取出來，然后分別用酶標(biāo)儀檢測細胞在510 nm 下的OD 值，計算平均值，做出2 種細胞的脂肪含量積累曲線。

1.4.5 細胞RNA 提取以及熒光定量PCR 將2 種細胞接種到6 孔板誘導(dǎo)分化，分別在0、2、4、6 d 提取細胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Primier 5.0 設(shè)計PPARγ、LPL、CEBPα、FAS 和GAPDH 的熒光定量引物（表1），并由生工生物工程股份有限公司合成（中國上海），其中GAPDH 持家基因作為內(nèi)參。反應(yīng)體系20 μL：2× TB Green Premix Ex Taq 10 μL 終 濃 度 為1× TB Green Premix Ex Taq，上、下游引物各0.4 μL，終濃度為0.2 μ moL/L，cDNA 模板2 μL 終濃度為5 ng/μL ，ddH2O 7.2 μL。利用LightCycler?96 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)，檢測2 種前體脂肪細胞分化過程中相關(guān)基因的表達情況；采用2-ΔΔCt的方法計算基因的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計分析 所有實驗均設(shè)置3 次重復(fù)，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20 統(tǒng)計分析軟件中的One-way ANOVA 進行方差分析，通過Duncan's 方法進行多重比較，顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

表1 熒光定量PCR 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 原代培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察 肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞在分離后的2 h 已經(jīng)貼壁；24 h 時細胞呈現(xiàn)出短梭形和不規(guī)則的三角形的細胞形態(tài)（圖1-A 和E）；第2 天細胞變成長梭形（圖1-B 和F）；在第6 天培養(yǎng)瓶內(nèi)出現(xiàn)一些成熟的脂肪細胞（圖1-C 和G）；原代培養(yǎng)第8 天，細胞長滿培養(yǎng)瓶，甚至出現(xiàn)重疊生長，有一些細胞脫落浮于培養(yǎng)基上（圖1-D 和H）。

圖1 肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞的原代細養(yǎng)

圖2 肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞的傳代培養(yǎng)

肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞傳代后生長良好，在傳代后1 d 細胞就已經(jīng)變成長梭形（圖2-A 和C）；相比于原代培養(yǎng)到8 d 的狀態(tài)，傳代第8 天細胞長滿培養(yǎng)瓶，其排列更加有序，沒有出現(xiàn)重疊生長的現(xiàn)象（圖2-B和D）。

2.2 前體脂肪細胞的生長曲線 經(jīng)CCK-8 試劑盒檢測，肌內(nèi)與皮下前體脂肪細胞的生長曲線均呈S 型（圖3），符合細胞的體外生長規(guī)律。肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞均在3～8 d 為對數(shù)生長期，6～7 d 左右細胞密度達到80%左右，達到8 d 之后為平臺期。但肌內(nèi)前體脂肪細胞的生長速度在第2～4 天高于皮下前體脂肪細胞（P＜0.05）。

圖3 前體脂肪細胞的增殖曲線

2.3 誘導(dǎo)分化和油紅O 染色 在誘導(dǎo)分化前對細胞進行油紅O 染色，結(jié)果表明細胞內(nèi)具有少量脂質(zhì)，且較為分散（圖4-A 和C）。隨著誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和維持分化培養(yǎng)基的加入，脂滴逐漸增多，并由分散的小脂滴逐漸變成大脂滴，脂滴占細胞的比例增大（圖4-B 和D）。分化前后的細胞經(jīng)油紅O 染色后差異顯著。

圖4 肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞油紅O 染色

圖5 表明，在誘導(dǎo)分化第2 天皮下前體脂肪細胞脂質(zhì)含量高于肌內(nèi)前體脂肪細胞（P＜0.05），在第12 天脂質(zhì)積累達到最大值。

2.4 分化相關(guān)基因的表達檢測 熒光定量結(jié)果表明（圖6），無論在肌內(nèi)還是皮下前體脂肪細胞，PPARγ、CEBPα 基因的表達量均在第2 天達到最大值，顯著高于0、4、6 d 的表達量（P＜0.05）。皮下前體脂肪細胞在誘導(dǎo)分化LPL 基因在第2 天表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；而肌內(nèi)前體脂肪細胞LPL 基因的表達在誘導(dǎo)分化的前2 d差異不顯著，但兩者在誘導(dǎo)分化過程中總體呈現(xiàn)表達量逐漸升高的趨勢。肌內(nèi)前體脂肪細胞中FAS 基因的表達量在誘導(dǎo)分化的第6 天顯著上調(diào)（P＜0.05）；而在皮下前體脂肪細胞中FAS 基因在第2 天顯著升高（P＜0.05）。

圖5 肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞的脂質(zhì)含量變化曲線

3 討 論

本研究利用膠原酶消化方法[5]成功獲得了新西蘭兔肌內(nèi)和皮下脂肪的前體脂肪細胞，并進行了原代和傳代培養(yǎng)以及前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細胞，油紅O 染色結(jié)果證明了誘導(dǎo)分化成功[6]。同時，肌內(nèi)和皮下脂肪的前體脂肪細胞的誘導(dǎo)分化過程中脂質(zhì)積累存在著差異[7]，表明皮下前體脂肪細胞可能在誘導(dǎo)分化的前期脂質(zhì)累積快于肌內(nèi)前體脂肪細胞。本研究通過CCK-8 試劑繪制了細胞生長曲線，結(jié)果表明分離培養(yǎng)的2 種前體脂肪細胞均符合細胞的增殖規(guī)律[8]，其增殖曲線均符合S 形曲線[9]，說明細胞生長狀態(tài)正常。

圖6 肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞分化過程中PPARγ、C/EBPα、LPL、FAS 基因表達

前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的過程中涉及轉(zhuǎn)錄因子PPARs、C/EBPs 等調(diào)控。PPARs 分為3 種亞型，即α、β 和γ[10]。通過下調(diào) PPARγ，小鼠3T3-L1 前脂肪細胞向脂肪細胞分化受到明顯的抑制，PPARγ 是前體脂肪細胞分化的重要標(biāo)志基因，對前體脂肪細胞的分化具有正調(diào)控作用[11]。PPARγ 基因在在肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞中的表達量均在誘導(dǎo)48 h 時達到最大值[12]，之后表達量慢慢降低，符合前體脂肪細胞PPARγ 基因的表達規(guī)律，但對比肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞PPARγ 基因在誘導(dǎo)分化后期表達趨勢上的差異，說明肌內(nèi)前體脂肪細胞在后期還處于分化過程中，可能是因為其分化晚于皮下前體脂肪細胞[13]。C/EBPs 家族包括C/EBPα、C/EBPβ 和C/EBPδ 等成員[14]。C/EBPα 在前體脂肪細胞分化中具有重要作用，C/EBPα 與 PPARγ 通過協(xié)調(diào)作用來影響脂肪細胞分化，對前體脂肪細胞分化具有正向調(diào)控作用，C/EBPα 基因的表達量在誘導(dǎo)分化的第2 天達到最大，隨后表達量下降[15]，與本研究結(jié)果一致。本實驗中，C/EBPα 基因在肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞中表達趨勢相同。LPL 是調(diào)控脂質(zhì)分解的關(guān)鍵基因，其生理功能是催化乳糜微粒（CM）和極低密度脂蛋白（VLDL）核心的甘油三酯（TG）分解為脂肪酸和單酸甘油酯，以供組織氧化供能和貯存，屬于脂解的關(guān)鍵酶[16]。本實驗中，肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞LPL 基因在誘導(dǎo)分化前期表達趨勢的差異表明，在細胞誘導(dǎo)分化前期肌內(nèi)前體脂肪細胞的脂肪酸含量低于皮下前體脂肪細胞，意味著皮下前體脂肪細胞脂肪酸合成高于肌內(nèi)前體脂肪細胞。FAS 基因編碼脂肪酸合成酶，脂肪酸合成酶是一種脂肪生成酶，在脂肪酸的合成中發(fā)揮重要作用[17-18]。本實驗中肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞FAS 基因的表達趨勢在誘導(dǎo)分化前中期呈現(xiàn)出差異，也表明了皮下前體脂肪細胞脂質(zhì)積累快于肌內(nèi)前體脂肪細胞。根據(jù)細胞的脂質(zhì)積累曲線，并且結(jié)合脂質(zhì)合成與分解以及分化相關(guān)基因FAS、LPL、PPARγ 在誘導(dǎo)分化過程中表現(xiàn)出的差異，分析原因在于皮下前體脂肪細胞的細胞分化和脂質(zhì)積累早于肌內(nèi)前體脂肪細胞。

4結(jié) 論

本研究通過膠原酶消化的方法，成功構(gòu)建了新西蘭兔肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化模型，且肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞脂質(zhì)積累以及PPARγ、LPL 和FAS 基因的表達趨勢的差異表明皮下前體脂肪細胞分化早于肌內(nèi)前體脂肪細胞。