王丹丹，裴軼勁

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是通過誘導(dǎo)成熟的體細(xì)胞表達(dá)特定基因得到的與胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）類似的細(xì)胞類型[1]。iPSCs 和 ESCs 在體外均具有無限增殖和多向分化的能力，兩者在藥物篩選、細(xì)胞治療等方面都發(fā)揮著重要作用，然而 iPSCs 來源廣泛，取材方便，其獲取可以避免醫(yī)學(xué)倫理問題。傳統(tǒng)的發(fā)育毒性研究方法不僅需要大量的實驗動物，而且實驗周期長，操作繁瑣，還存在種屬差異。1981年，Evans 和 Kaufman[2]首次從小鼠的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中獲得小鼠 ESCs。1997年，Spielmann 等[3]利用小鼠 ESCs 向三胚層分化的特性建立了體外替代模型“胚胎干細(xì)胞試驗”，并成為體外發(fā)育毒性研究的經(jīng)典方法。隨后，人 ESCs 和人 iPSCs 被人們獲取并應(yīng)用于發(fā)育毒性體外替代模型中，這些人類細(xì)胞的應(yīng)用解決了種屬差異問題[4-6]。體外發(fā)育毒性模型最初是通過多能干細(xì)胞向心肌分化來評估化學(xué)物質(zhì)的毒性作用，之后向其他譜系分化的產(chǎn)物也逐漸被應(yīng)用到該模型中。

神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程具有高度的時空性，對毒性物質(zhì)的敏感性取決于所處的發(fā)育階段，處于敏感階段時，即使較低的毒性物質(zhì)暴露水平也會造成不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷[7]。這種腦損傷有時并未表現(xiàn)出明顯的臨床特征，而是神經(jīng)系統(tǒng)的持續(xù)性改變，被稱為“無聲發(fā)育毒性”[8]。除了神經(jīng)系統(tǒng)本身的脆弱性外，人類所接觸的神經(jīng)發(fā)育毒性（developmental neurotoxicity，DNT）物質(zhì)也逐漸增多。據(jù)統(tǒng)計顯示，從 2006年到 2013年DNT 物質(zhì)從 6 種增長至 12 種[9]。因此，DNT 問題越來越引起人們的重視。目前，利用多能干細(xì)胞建立體外細(xì)胞模型已經(jīng)成為 DNT 研究的重要途徑。由多能干細(xì)胞分化的神經(jīng)譜系細(xì)胞類型和 DNT 評估方法則成為該研究的重要環(huán)節(jié)。本文從多能干細(xì)胞向神經(jīng)譜系的分化、DNT 檢測指標(biāo)與應(yīng)用、高通量技術(shù)應(yīng)用、前景與挑戰(zhàn)等四個方面進(jìn)行綜述。

1 多能干細(xì)胞向神經(jīng)譜系的分化

利用多能干細(xì)胞建立 DNT 研究的體外細(xì)胞模型，有賴于多能干細(xì)胞向神經(jīng)譜系分化技術(shù)的發(fā)展。隨著干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，多能干細(xì)胞向神經(jīng)譜系分化的細(xì)胞類型也越來越多（表1），其分化方法主要有兩種：貼壁法和擬胚體（embryoid body，EB）法。貼壁法相對簡單，易于操作；EB 法盡管存在操作復(fù)雜、EB 大小難以控制、生長因子接觸不均衡等問題，但和貼壁法相比更接近自然狀態(tài)下的胚胎發(fā)育過程。

表1 多能干細(xì)胞向神經(jīng)譜系分化的概況

續(xù)表1

目前，利用多能干細(xì)胞分化產(chǎn)生的神經(jīng)譜系細(xì)胞類型有多巴胺神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等[10-20]，分化形成的神經(jīng)譜系細(xì)胞類型逐漸增多，空間結(jié)構(gòu)也經(jīng)歷了由二維到三維的轉(zhuǎn)變。例如，Reichman 等[19]誘導(dǎo)人 iPSCs 形成含有超微結(jié)構(gòu)光感受器的類視網(wǎng)膜器官；Pamies 等[21]利用 iPSCs 分化形成類似人腦的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由分化成熟的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞組成，可以模擬神經(jīng)發(fā)育過程中的突觸形成、神經(jīng)元自發(fā)放電和髓鞘形成等，其髓鞘化可達(dá) 40%。此外，Schwartz 等[22]通過將人 ESCs 分化得到的神經(jīng)祖細(xì)胞接種在人工合成的聚乙二醇水凝膠上進(jìn)行培養(yǎng)，在其分化過程中再按一定比例添加 ESCs 來源的內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞前體，最終形成一個含有不同類型神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞群和相互連接血管網(wǎng)的三維神經(jīng)結(jié)構(gòu)。

總之，利用多能干細(xì)胞產(chǎn)生的不同類型的神經(jīng)細(xì)胞是體外 DNT 研究的重要基礎(chǔ)，還可以依據(jù)不同細(xì)胞類型對不同性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)敏感程度不同，如神經(jīng)祖細(xì)胞對誘導(dǎo)凋亡的化學(xué)物質(zhì)較為敏感[23]，建立專一性的細(xì)胞替代模型。除此之外，由多能干細(xì)胞分化產(chǎn)生的三維神經(jīng)結(jié)構(gòu)可模擬細(xì)胞間的相互作用，在結(jié)構(gòu)和功能上更接近體內(nèi)神經(jīng)組織，應(yīng)用于 DNT 研究可縮小細(xì)胞水平與體內(nèi)水平的差異，進(jìn)一步提高 DNT 評估的準(zhǔn)確性。

2 DNT 檢測指標(biāo)與應(yīng)用

神經(jīng)發(fā)育過程包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移、突觸形成、突起和網(wǎng)絡(luò)形成、膠質(zhì)生成和髓鞘化等。利用多能干細(xì)胞模擬神經(jīng)發(fā)育過程進(jìn)而評估化學(xué)物質(zhì)的 DNT，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)實驗的不足，但根據(jù)細(xì)胞模型如何全面準(zhǔn)確地評估化學(xué)物質(zhì)的 DNT 則是人們研究的難點。目前，體外評估 DNT 的檢測指標(biāo)大致分為三類：神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)行為、神經(jīng)元功能及其他指標(biāo)。

2.1 神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)行為

⑴增殖和凋亡：增殖和凋亡貫穿整個神經(jīng)發(fā)育過程，可依據(jù)細(xì)胞模型的增殖和凋亡水平初步評估化學(xué)物質(zhì)的 DNT，常用的相關(guān)檢測方法包括細(xì)胞計數(shù)、BrdU 染色法、CCK8、caspase3/7 活性等[23-30]。

⑵分化：多能干細(xì)胞分化形成形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能不同的神經(jīng)元，其本質(zhì)是基因的選擇性表達(dá)。通常采用實時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、免疫染色等方法檢測特異性標(biāo)記物如神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白、髓鞘堿性蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而評估毒性物質(zhì)對神經(jīng)分化過程的影響[31-32]。

⑶細(xì)胞遷移：神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移是人類胎兒發(fā)育的關(guān)鍵過程之一，倘若該過程受到外部環(huán)境或毒性物質(zhì)的干擾，胎兒會出現(xiàn)畸形發(fā)育。體外主要采用細(xì)胞劃痕實驗來評估毒性物質(zhì)對細(xì)胞遷移過程的影響[33-34]。

⑷突起生長：神經(jīng)元之間通過神經(jīng)突起相互連接進(jìn)行信息的傳遞。Ryan 等[35]利用人 iPSCs 來源的神經(jīng)元研究發(fā)現(xiàn)，一些化學(xué)物質(zhì)并未引起細(xì)胞毒性，僅選擇性地抑制神經(jīng)元突起生長。可見，突起生長可作為評估 DNT 的重要指標(biāo)。

⑸髓鞘化：髓鞘的主要功能是提供軸突的電絕緣和加速電信號的傳遞，少突膠質(zhì)細(xì)胞是髓鞘的重要細(xì)胞來源，可通過檢測其前體細(xì)胞分化、遷移等過程間接評估化學(xué)物質(zhì)對髓鞘形成影響[24,36-37]。

2.2 神經(jīng)元功能

現(xiàn)有的研究顯示，采取常規(guī)的檢測手段不一定能夠發(fā)現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)的毒性作用。而電生理特性作為神經(jīng)元基本的功能特性，可作為評估 DNT 敏感的功能終端。例如，Yl?-Outinen 等[38]將人 ESCs 分化的神經(jīng)元在 500 nmol/L 氯化甲基汞環(huán)境中暴露 72 h 后，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的電生理信號會顯著減少，但細(xì)胞增殖、qPCR、免疫染色等檢測結(jié)果并未發(fā)生改變。

2.3 其他指標(biāo)

除了以上兩類檢測指標(biāo)外，還可通過其他指標(biāo)來評估 DNT。

⑴活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激：氧化應(yīng)激是化學(xué)物質(zhì)引起 DNT 的重要機(jī)制[39-40]。例如，砷、汞等會引起神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生過多 ROS，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡即氧化應(yīng)激水平升高，進(jìn)而引起線粒體功能失調(diào)和細(xì)胞凋亡[41-42]。因此，可依據(jù)多能干細(xì)胞向神經(jīng)分化過程中細(xì)胞內(nèi) ROS 水平、超氧化物歧化酶等指標(biāo)來評估化學(xué)物質(zhì)的 DNT[43]。

⑵代謝產(chǎn)物：Pamies 等[43]利用非靶向性代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，由人 iPSCs 分化形成的三維神經(jīng)結(jié)構(gòu)在不同的分化階段其代謝產(chǎn)物存在差異，同時，用魚藤酮處理 48 h 后細(xì)胞代謝產(chǎn)物亦發(fā)生明顯改變。因此，研究細(xì)胞的代謝產(chǎn)物可以幫助人們從代謝角度發(fā)現(xiàn)微小差異，并進(jìn)一步識別化學(xué)物質(zhì)的毒性作用。

⑶microRNA（miRNA）：miRNA 是一種小的內(nèi)源性非編碼 RNA 分子，通過靶向結(jié)合 mRNA 來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。目前，已經(jīng)明確的 miRNA 中超過 50% 在腦中表達(dá)，參與調(diào)控腦的發(fā)育過程[44]。已有研究表明，毒性物質(zhì)會引 起一些 miRNA 的異常表達(dá)，而這些 miRNA 與神經(jīng)細(xì)胞的增殖、遷移、髓鞘化等密切相關(guān)[45]。

總之，神經(jīng)發(fā)育過程極其復(fù)雜，利用多能干細(xì)胞建立體外細(xì)胞模型評估 DNT 時，需要綜合不同的檢測指標(biāo)才能對化學(xué)物質(zhì)的 DNT 做出正確的評估，相信隨著科技的發(fā)展，更多敏感指標(biāo)會被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于 DNT 研究中。

3 DNT 高通量技術(shù)應(yīng)用

盡管利用多能干細(xì)胞建立體外替代模型評估化學(xué)物質(zhì) DNT 和傳統(tǒng)方法相比具有較多優(yōu)點，但對大量的細(xì)胞樣本進(jìn)行不同的處理和檢測同樣具有挑戰(zhàn)性?；隗w外模型能高效準(zhǔn)確地預(yù)測出體內(nèi)結(jié)果是 DNT 研究的關(guān)鍵，因此，高通量技術(shù)對于體外 DNT 研究十分必要。目前，利用多能干細(xì)胞研究 DNT 方法中也出現(xiàn)一些高通量技術(shù)應(yīng)用。

⑴高含量成像分析（high content imaging analysis，HCA）技術(shù)：HCA 是一種能夠高通量成像并可對圖像信息進(jìn)行多種模型量化分析的重要工具，可用于大量化學(xué)物質(zhì)的毒性檢測[46]。例如，有研究報道將 80 種化學(xué)物質(zhì)分別作用 iPSCs 來源的神經(jīng)元 72 h 后，應(yīng)用 HCA 技術(shù)對其進(jìn)行拍照，并從神經(jīng)元的細(xì)胞活性、突起長度、突起數(shù)目、分支數(shù)等 4 個參數(shù)分析圖像信息，極大提高了圖像信息的處理能力[35]。

⑵微流控芯片：微流控芯片是一個集細(xì)胞培養(yǎng)、分化、處理和檢測分析于一體的微型平臺，可進(jìn)行二維和三維兩種干細(xì)胞培養(yǎng)方式，和不同的檢測系統(tǒng)結(jié)合可對細(xì)胞樣本進(jìn)行不同指標(biāo)的分析[47]。該平臺應(yīng)用于 DNT 研究中，不僅可以實現(xiàn)對大量化學(xué)物質(zhì)的自動處理，還可以從不同的指標(biāo)分析化學(xué)物質(zhì)的 DNT，提高 DNT 的研究效率和評估準(zhǔn)確性。

⑶微電極陣列（microelectrode array，MEA）：MEA 是一種無創(chuàng)性的微電極細(xì)胞外電信號記錄技術(shù)，可以用于長時間培養(yǎng)細(xì)胞，實時記錄不同樣本產(chǎn)生的電信號，是高通量檢測神經(jīng)細(xì)胞電生理特性的重要工具[48-50]。

盡管高通量技術(shù)在一定程度上可以對大量樣本進(jìn)行檢測和分析，但大部分高通量技術(shù)由于設(shè)備成本較高，操作復(fù)雜，需借助專業(yè)技術(shù)人員，還無法實現(xiàn)廣泛應(yīng)用。但隨著科技的進(jìn)步，相信越來越多的高通量技術(shù)會得到進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用，從而提高利用多能干細(xì)胞評估 DNT 的研究效率和評估準(zhǔn)確性。

4 前景和挑戰(zhàn)

目前，多能干細(xì)胞研究已經(jīng)取得很大進(jìn)展，例如，多能干細(xì)胞培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化，即無血清和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，成分更加明確，有利于實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。另外，利用多能干細(xì)胞在體外分化形成神經(jīng)細(xì)胞類型的多樣性（表1）、DNT 檢測指標(biāo)的多樣性、高通量檢測技術(shù)應(yīng)用等，這些在一定程度上均有助于降低研究成本，縮短 DNT 研究周期，提高預(yù)測準(zhǔn)確性等。但利用多能干細(xì)胞進(jìn)行 DNT 研究也同樣面臨很多問題，如干細(xì)胞培養(yǎng)成本較高、神經(jīng)三維模型分化時間較長、對神經(jīng)組織（或細(xì)胞）模型缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的評估體系、化 學(xué)物質(zhì)的暴露方式不一（濃度、作用時間等）、化學(xué)物質(zhì)作用的細(xì)胞類型可能不敏感；檢測體系待完善等。此外，盡管由多能干細(xì)胞分化形成的三維模型已經(jīng)具備初步的結(jié)構(gòu)和功能，但與人體內(nèi)的神經(jīng)組織相比依然存在很大差距。而且目前體外檢測系統(tǒng)只能檢測化學(xué)物質(zhì)本身的毒性作用，對化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)代謝過程產(chǎn)生的毒性作用及體內(nèi)胎盤屏障和血腦屏障的復(fù)合作用均無法在體外模擬，這將容易造成高估或者低估化學(xué)物質(zhì)的 DNT[51]?？傊?，盡管應(yīng)用多能干細(xì)胞在體外建立細(xì)胞模型研究 DNT 還存在很多不足，但隨著相關(guān)技術(shù)的成熟和完善，相信多能干細(xì)胞尤其 iPSCs 在未來 DNT 體外模型應(yīng)用中將發(fā)揮不可替代的作用。