李令臣，侯力嘉，吳勝昔，李俊萱，魯友銘，徐 緣，李 志，曾 政，梁望旺

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054； 2.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 重慶 401120)

禽流感，是由A型流感病毒引起的從呼吸系統(tǒng)病變到全身性敗血癥的一種高度接觸性急性傳染病[1-3]。據(jù)世衛(wèi)組織稱，自2003年以來，全球已報(bào)告860例人感染H5N1型流感病毒病例，意味著該病毒具有感染人類的潛力。在不斷研究中，發(fā)現(xiàn)此類病毒可能對(duì)家禽工業(yè)和人類公共衛(wèi)生構(gòu)成潛在威脅，因此對(duì)病毒進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)和鑒定對(duì)于預(yù)防任何可能的疾病暴發(fā)至關(guān)重要。

高致病性禽流感(HPAI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬的H5亞型或H7亞型禽流感病毒(AIV)引起的[6]，其基因組由8個(gè)分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA組成，共編碼11種蛋白[7]。血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)是作為目前存在于甲型流感病毒(IAV)包膜上的最主要表面糖蛋白，許多研究都致力于了解HA的結(jié)構(gòu)及其抗原性[8-9]。本研究擬在不改變HA蛋白氨基酸序列的情況下，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化基因序列，化學(xué)合成HA全基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+)中，構(gòu)建pET28a(+)-HA重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以期建立低廉、快速、高效的HA重組蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)，為后續(xù)疫苗及診斷方法的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用大腸桿菌BL21(DE3)、感受態(tài)DH5α菌株購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司；所用pET28a(+)質(zhì)粒由重慶理工大學(xué)基因工程實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

DNA Marker、QuickCut BamHI、QuickCut EcoRI限制性內(nèi)切酶，購(gòu)自TaKaRa；小型質(zhì)粒提取試劑盒、小量膠回收試劑盒，購(gòu)自重慶威斯騰生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司。

1.3 序列分析與合成

根據(jù)從NCBI的基因數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中査取的禽流感 HA(ID=DQ023145.1)的基因組序列，利用DNAWorks2.4軟件進(jìn)行密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)。Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，通過設(shè)計(jì)在序列上游引物P1中引入EcoRI (堿基序列為GAATTC)限制性酶切位點(diǎn)，在序列下游引物P2中引入BamHI (堿基序列為GGATTC)限制性酶切位點(diǎn)，此引物交由上海生工生物工程有限公司合成。引物P1、P2序列如下：

P1：

5′-GACGAATTCACCAATGTGCCGGAATGG-3′

(含EcoRI 酶切位點(diǎn))；

P2：

5′-GGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGG-3′

(含BamHI酶切位點(diǎn))。

1.4 pET28a(+)-HA重組載體的構(gòu)建

將含有禽流感HA 基因的TOP10甘油菌在無菌條件下劃線培養(yǎng)后，挑菌入小試管再培養(yǎng)。得到大量菌體后，離心并用DNA小量提取試劑盒提取含有HA基因的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切鑒定。利用瓊脂糖凝膠電泳得到有效切割的HA基因片段。鑒定正確的HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主[BL21(DE3)]中，將其大量擴(kuò)增，留取部分做菌株保存。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將鑒定成功的菌株大量擴(kuò)增，使菌濃度OD600 nm值在0.6～0.8之間時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG。進(jìn)行誘導(dǎo)溫度(20、25、30、37 ℃)、IPTG濃度(0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L)、誘導(dǎo)時(shí)間(8、10、12、16 h)的篩選。取出0.5 mL 菌液，10 000 r/min 離心 5 min，棄上清，沉淀重懸于 40 μL 1×PBS，并加入10 μL 5×SDS-PAGE 凝膠電泳上樣緩沖液，100 ℃變性 10 min進(jìn)行 SDS-PAGE電泳。按優(yōu)化后的最佳條件重新誘導(dǎo)表達(dá)，采用蛋白純化儀的Ni柱蛋白純化得到重組HA蛋白，利用電泳鑒定。

1.6 蛋白質(zhì)印記(Western blot)分析

經(jīng)過鎳柱純化后得到的HA重組蛋白要經(jīng)過Western免疫印跡鑒定分析，具體步驟參見文獻(xiàn)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a(+)-HA酶切鑒定

重組質(zhì)粒pET28a(+)-HA經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后電泳，分別切出與對(duì)應(yīng)目的基因大小相符的條帶(1 740 bp)以及與空載體pET28a(+)大小相符約5 369 bp的另一條帶(見圖1)。這表明已成功構(gòu)建重組表達(dá)載體。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET28a(+)-HA經(jīng)IPTG誘導(dǎo)破菌，分別取適量的沉淀(滅菌水溶解)和上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果表明：當(dāng)誘導(dǎo)條件為30 ℃、IPTG 1 mmol/L誘導(dǎo)8 h時(shí)，蛋白表達(dá)最高，在70 kD處有一條明顯的蛋白條帶(見圖2)，與預(yù)期大小相一致，說明pET28a(+)-HA成功表達(dá)。且重組菌在上清和沉淀中顯示70 kD的條帶，上清表達(dá)明顯高于沉淀(見圖3、4)。

M1、M2：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：pET28a(+)-HA的雙酶切產(chǎn)物

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3、5、7：20、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1IPTG,10h)條件下重組菌pET28a(+)-HA/BL21(DE3)經(jīng)裂解液破碎后的上清； 2、 4、 6、 8： 20、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1IPTG,10 h)條件下重組菌pET28a(+)-HA/BL21(DE3)經(jīng)裂解液破碎后的沉淀

圖2 HA蛋白在不同誘導(dǎo)溫度條件下SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3、5：0.1、0.5 、1 mmol·L-1IPTG(30 ℃,10 h)條件下重組菌pET28a(+)-HA/BL21(DE3)經(jīng)裂解液破碎后的上清； 2、 4、 6： 0.1、0.5、1 mmol·L-1IPTG(30 ℃,10 h)條件下重組菌pET28a(+)-HA/BL21(DE3)經(jīng)裂解液破碎后的沉淀

圖3 HA蛋白在不同誘導(dǎo)劑量條件下SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3、4、5、6、7：分別為2、4、6、8、10、12、14 h(1 mmol·L-1IPTG,30℃)條件下重組菌pET28a(+)-HA/BL21(DE3)經(jīng)裂解液破碎后的上清

圖4 HA蛋白在不同誘導(dǎo)時(shí)間條件下SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

2.3 重組蛋白PET28a(+)-HA純化及Western blot分析

利用最大濃度咪唑(imidazole)線性洗脫后確定最佳的洗脫濃度，并進(jìn)行完全洗脫，收集洗脫液，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳鑒定(見圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在150 mM的咪唑濃度可將大部分目的蛋白洗脫下來。純化后的重組蛋白經(jīng)Western blot鑒定后發(fā)現(xiàn)：在70 kD處有特異性條帶，與預(yù)期的目的蛋白的大小相符(圖6)。

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.空載體pET28a(+)感受態(tài)細(xì)菌超聲破碎后沉淀；2.重組菌pET28a(+)-HA/BL21(DE3) 經(jīng)裂解液破碎后的上清；3.HA穿透液；4.20 mM咪唑洗脫蛋白；5.50 mM咪唑洗脫蛋白；6.100 mM咪唑洗脫蛋白；7.150 mM咪唑洗脫蛋白；8.250 mM咪唑洗脫蛋白。

圖5 HA純化蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.純化后的重組HA蛋白；2.空載體pET28a(+)感受態(tài)細(xì)菌對(duì)照

圖6 HA蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果

3 討論

近年來隨著各類禽流感的多次大規(guī)模暴發(fā),對(duì)感染的家禽只能大批量捕殺。隨著病毒加速變異，在國(guó)內(nèi)也出現(xiàn)了多例關(guān)于人感染高致病性禽流感死亡的相關(guān)報(bào)道。禽流感 H5N1 亞型是能夠通過家禽傳染給人類的高致病型禽流感，每年疫情爆發(fā)時(shí)期均產(chǎn)生大規(guī)模的公眾恐慌。國(guó)內(nèi)的研究人員在有關(guān)禽流感H5N1的病原學(xué)、致病機(jī)制、爆發(fā)規(guī)律以及預(yù)防措施方面都有較為深入的研究。本實(shí)驗(yàn)采用的成本低廉、周期短的原核表達(dá)系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于診斷試劑、亞單位疫苗生產(chǎn)和蛋白功能的研究等方面[10-12]。

本研究根據(jù) GeneBank 已發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)并合成了HA的特異性引物，并選擇pET28a(+)作為表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，在載體上兩端都帶有多聚組氨酸標(biāo)簽(His-tag)，可以和鎳柱與咪唑發(fā)生相互作用，從而有利于蛋白的親和純化。在篩選最佳誘導(dǎo)條件中，經(jīng)過對(duì)溫度、時(shí)間、IPTG濃度等因素的重復(fù)試驗(yàn)，逐漸摸索出重組質(zhì)粒PET28a(+)-HA在30 ℃、IPTG濃度在1 mmol/L誘導(dǎo)8 h時(shí)蛋白表達(dá)量最大。鑒定結(jié)果顯示：純化后的重組蛋白可達(dá)到較高的濃度，但純化結(jié)果略有雜蛋白，可能的原因在于蛋白洗脫濃度階梯需要進(jìn)一步優(yōu)化，后期將以更精準(zhǔn)的咪唑濃度洗脫以獲得高純度的HA蛋白。在后期ELISA實(shí)驗(yàn)中,所得重組蛋白與相關(guān)病毒血清有強(qiáng)烈反應(yīng)(數(shù)值略)，所以所得重組蛋白具有相似的免疫原性。吳艷菊等[13]將H5N1亞型的NS1 和NA蛋白進(jìn)行包涵體原核表達(dá)，得到的蛋白免疫小鼠效果良好；鄒淑梅等[14]利用包涵體表達(dá)，利用8 mol/L的尿素洗脫蛋白，表達(dá)量占總蛋白的90%。對(duì)于可溶性表達(dá)，包涵體表達(dá)量高、蛋白折疊度好。但蛋白本身無活性，需要蛋白復(fù)性等操作，因此建議比較分析其他蛋白的原核誘導(dǎo)表達(dá)條件、異同及其原因。

本研究獲得的重組HA蛋白將為后續(xù)開展禽流感檢測(cè)方法及疫苗的研究提供參考。