王新天，王衛(wèi)斌，陳升位，賀軍與，朱思德，莫 凡，余 其，張婷婷，李玉平

(云南農業(yè)大學農學與生物技術學院，云南昆明 650201)

在長期的進化過程中，大麥形成了特有的穗發(fā)育模式，即穗軸無分枝、每個穗軸節(jié)上著生1個三聯小穗[1]。通過自然[2-3]和人工誘變[4-5]可改變大麥的穗發(fā)育模式，獲得穗分枝突變體。目前，已報道了多種穗發(fā)育突變體，如莖分枝、復小穗和支穗等多種突變體[2-6]，其中，穗分枝大麥突變體4個，即Foma突變體[3]、 Prbs突變體[4]、F151突變體[2]和Ynbs突變體[5]，這些突變體均可穩(wěn)定遺傳[2-3,5,8-9]。Larsson 等[7]發(fā)現，Foma突變體的穗分枝性狀受1對隱性核基因控制，該基因與小穗軸短毛基因(s)連鎖，位于7H 染色體。黃碧云等[7-9]通過 Prbs突變體與蒲大麥2號等品種雜交后代的遺傳分析，發(fā)現該突變體的穗分枝性狀受1對隱性核基因(Prbs)控制，并將其定位在3H染色體短臂的2個SSR標記HvLTPPB和Bmag0508A之間[8-10]。馮宗云等[2]研究發(fā)現，F151突變體的穗分枝性狀也受1對隱性核基因控制，并將其定位在4H染色體短臂的SSR標記HVM40和RFLP標記CDO669之間，該基因與標記位點分別相距8.7 cM和5.8 cM。雖然大多數報道認為大麥穗分枝遺傳受1對隱性核基因控制，但黃碧光等[9]認為， Prbs突變體的穗分枝性狀遺傳可能受主基因和微效多基因控制。

大麥穗分枝突變體的多聯(或三聯)小穗和單花小穗增多，但結實率卻普遍下降[2-5]。有報道表明，Vsr類基因控制大麥三聯小穗的側小穗育性[11-18]，其中，Vsr1基因位于2H 染色體長臂，該基因突變后大麥三聯小穗中的側小穗可育[16,18]，但其表達受Int-c基因編碼的轉錄因子調控[19-21]。除Vrs1外，大麥1H、3H 和5H 染色體還分別攜帶有三聯小穗中單花小穗育性的基因Vrs2[15]、Vrs3[11,14]和Vrs4[12]。雖然Int-c基因可調控Vsr1基因并控制單花小穗育性，但不影響Vrs2、Vrs3和Vrs4基因的遺傳效應[19,21]。尚 毅等[12]發(fā)現， Prbs 突變體的穗分枝發(fā)育起始于二棱期末，在三聯小穗原基基部可看到明顯的穗分枝原基，且其分化與單花小穗等花器官的發(fā)育形成關聯。雖然少有穗分枝基因與Int類和Vsr類基因互作的報道，但從形態(tài)結構看，大麥二棱穗、六棱穗和穗分枝都具有相似的主穗軸結構和各種花器結構。推測大麥分枝穗和單花小穗等穗部性狀的發(fā)育遺傳基因可能存在某種調控關系。

與Foma等3個突變體相比，Ynbs突變體具有較多的穗分枝以及小穗退化、單穗小花增多和結實率下降等典型特性[5]。王家曦等[22]分析了不同Ynbs株系的穗部特性差異及其穗分枝與小穗退化、單穗小花數和結實率等穗部特性的關聯性，但有關Ynbs突變體穗分枝性狀遺傳方面的研究還未見報道。本研究擬通過對Ynbs-1突變體及其重組自交系(正常六棱穗)等材料的正、反雜交F1植株的穗分枝特性觀測，分析F2及其F3群體中正常穗與分枝穗植株的分離狀況，對已報道的穗分枝基因連鎖SSR標記和小穗軸短毛標記進行檢測，解析Ynbs-1株系的穗分枝遺傳特性，為基于 Ynbs-1株系大麥穗分枝等性狀的遺傳機制研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括穗分枝突變體(Ynbs-1)、重組自交系(RIL-1)、北青7號、保大麥8號和多棱穗分枝大麥(表1)，Ynbs-1分別與RIL-1(正、反交)、保大麥8號和多棱穗分枝大麥(Prbs)的雜交F1、F2或F3群體。Ynbs-1和RIL-1均為北青7號成熟種子EMS誘變的1個M1植株的自交后代，由本課題組創(chuàng)制并保存，北青7號和保大麥8號分別由迪慶州農業(yè)科學研究所、保山市農業(yè)科學研究所提供，Prbs由浙江省農業(yè)科學院國家大麥改良中心提供，其中保大麥8號是云南省多年主推六棱大麥品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料的種植和繁育

2015年11月8日種植 Ynbs-1等5份材料、以及 Ynbs-1與RIL-1(正、反交)、BDM-8和Prbs的雜交F1植株；在開花前，分別隨機選取10株 Ynbs-1、RIL-1、BDM-8、 Prbs及 Ynbs-1分別與RIL-1和BMD-8雜交組合的全部F1植株套袋自交，在黃熟期采收種子。2016年11月13日種植Ynbs等5份試驗材料及RIL-1、BDM-8和 Prbs的雜交F2群體，10行F2材料間種植1行雜交親本和BQ-7(對照)；在開花前，隨機選取10株 Ynbs-1、RIL-1、BDM-8、 Prbs及 Ynbs-1分別與RIL-1和BMD-8雜交組合的全部F2植株套袋自交，在黃熟期采收種子。2017年11月11日種植 Ynbs-1、RIL-1、BDM-8、 Prbs及 Ynbs-1分別與RIL-1和BMD-8雜交組合的全部F3株系。所有材料均采用完全隨機排列，試驗地點均為云南農業(yè)大學昆明北市區(qū)教學實驗農場，株、行距分別5 cm和20 cm，其他田間管理措施同當地大麥常規(guī)栽培。

表1 5份試驗材料Table 1 Five materials used in the study

1.2.2 穗分枝特性和穗軸毛調查

在花后7 d，隨機選取 Ynbs-1和RIL-1的5個單株，用鑷子剝去穗子中的籽粒、芒和穎殼等組織，使穗軸和分枝穗完全裸露；調查分枝穗數、分枝穗長度和分枝穗軸節(jié)數。借助Deli手持放大鏡(輔助鏡、6倍)觀察小穗軸毛及其長度。

1.2.3 基因組DNA的提取和檢測

花后7 d，分別隨機選取 Ynbs-1、RIL-1及其雜交F2群體的分枝穗和正常穗的20個單株幼嫩葉片，采用CTAB法提基因組DNA，采用紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的濃度、完整性和純度。

1.2.4 SSR標記的擴增和檢測

用1.2.3中基因組DNA分別構建兩個雜交親本、F2群體分枝穗和正常穗的基因池。利用已報道的與穗分枝基因連鎖的3對SSR標記引物(表2)擴增所構建的4個基因池的基因組。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PCR擴增條件和程序均參照馮宗云等[2,9-10]方法，采用8%的聚苯稀酰胺凝膠電泳檢測擴增片段。

1.2.5 數據分析

采用下列公式分別計算F2(公式1)和F3(公式2)群體中分枝穗和正常穗植株(株系)觀察頻率的χ2值。

(1)

(2)

在公式中，Oi表示不同類型植株的觀測頻率，Ei表示不同穗型植株的理論頻率。

采用SPSS 19.0中的單因素分析模塊分析材料間農藝性狀表型差異。

2 結果與分析

2.1 Ynbs-1的穗分枝特性

由圖1可見， Ynbs-1的穗軸結構與RIL-1的具有明顯差異，RIL-1無分枝穗(圖1A、E)、 Ynbs-1具有數目不等的分枝穗(圖1B、F)。Ynbs-1的穗分枝長度、穗分枝數和分枝穗軸節(jié)數平均值分別為1.48±0.09 cm、23.56±1.52個和1.32±0.63個，均極顯著高于RIL-1的(P<0.01)。 Ynbs-1穗軸底部和頂部穗軸節(jié)上的分枝較短，大多只有1個分枝穗節(jié)，但中部分枝穗較長，大多具有3～5個分枝穗軸節(jié)(圖1F)。由于穗分枝有差異， Ynbs-1和RIL-1的小穗結構也存在差異，其中RIL-1具有典型的三聯小穗(圖1C)， Ynbs-1具有不規(guī)則多聯小穗(圖1D)。

表2 3個SSR標記的引物Table 2 Primers of three SSR markers linked to the genes controllong spike branch tested

2.2 穗分枝基因的質核屬性和顯隱性分析

觀察穗分枝突變體 Ynbs-1與RIL-1的正、反雜交F1植株的穗型和穗軸結構，發(fā)現F1植株均為正常穗，穗軸無分枝，三聯小穗均著生在主穗軸節(jié)上(圖2C、D)，表明控制 Ynbs-1突變體分枝穗遺傳的基因屬隱性核基因，分枝穗遺傳不受細胞質基因影響。

利用 Ynbs-1突變體分別與RIL-1和BDM-8雜交，通過F1單株套袋自交創(chuàng)制2個雜交F2群體。2個雜交F2群體均只有分枝穗和正常穗2種個體。χ2檢測結果表明，2種穗型的個體數比例均符合1∶3的分離比例(表3)，說明 Ynbs-1突變體的穗分枝性狀受1對隱性基因控制。為了驗證此觀點，本研究將2個雜交組合的F2單株分別套袋自交，創(chuàng)制F3株系。在2個雜交組合的F3株系中，由穗分枝F2單株自交產生的F3株系均未發(fā)生性狀分離，各株系的單株均為分枝穗。由正常穗F2單株自交產生的部分F3株系出現了正常穗和分枝穗，出現性狀分離的F3株系為329個，其余160個株系性狀不分離，χ2檢測結果表明3種株系的數目之比符合1∶2∶1。

A和B、C和D、E和F分別為 Ynbs-1和RIL-1的穗型、小穗、穗軸。

A and B,C and D,F and E show the spike,spikelet,rachis of Ynbs-1 and RIL-1,respectively.

圖1 試驗材料 Ynbs-1 和RIL-1 的穗部特性

Fig.1 Spike characteristics of experimental materials Ynbs-1 and RIL-1

2.3 穗分枝基因的等位性檢測

Ynbs-1(母本、圖3A)與 Prbs(圖3B)的雜交F1單株的穗軸均不分枝、穗軸節(jié)上著生三聯小穗(圖3C、D)。利用與穗分枝基因pbrs和bs(F151突變體的穗分枝基因)連鎖的3個SSR標記(HVM40、Bmag0023和Bmag0508A)分別擴增Ynbs-1、RLI-1及其雜交F2群體分枝穗、正常穗植株的基因池DNA，發(fā)現3對引物在4個基因池中的擴增片段均無明顯的長度差異(圖4)。Ynbs-1和RIL的小穗軸毛均屬短毛(接近無毛)型，且小穗軸毛長度沒有明顯差異(圖1E、F)。Ynbs-1的穗分枝基因與3個SSR標記和穗軸毛基因不連鎖，表明在3個SSR標記和穗軸毛基因的連鎖基因組區(qū)域不存在控制Ynbs-1穗分枝的基因，即Ynbs-1攜帶的穗分枝基因與 Prbs、F151和Foma突變體攜帶的不等位。

A、B、C和D分別為Ynbs-1突變體、重組自交系及其F1植株的穗型和小穗。

A,B,C and D show the spike and spikelets of Ynbs-1,RIL-1 and the plant of F1population from direct and reciprocal crosses between the two materials,respectively.

圖2 Ynbs-1、RIL-1及其正、反交F1植株的穗部特性

A、B、C、D：Ynbs-1、Prbs及其雜交F1植株的穗型和穗軸。

A，B，C，D：Spike of Ynbs-1，Prbs and the spike type and rachis of their F1.

圖3 Ynbs-1與Prbs及其雜交F1植株的穗部特性

Fig.3 Spike characteristics of Ynbs-1,Prbs and F1plant from the hybrid between Ynbs-1 and Prbs

M：Marker；1、14：水；2～5、6～9、10～13：Bmag0508V、HCM40和Bmag0023在Ynbs-1/RIL-1及其雜交F2群體正常穗和分枝穗植株的擴增片段。

M:Marker; 1 and 14:Water; 2-5,6-9 and 10-13:Fragments amplified from 4 gene pool of Ynbs-1，Prbs and F2plants with branc hed spike and normal spike byBmag0508V,HCM40andBmag0023,respectively.

圖4 在4個基因池中擴增的3個SSR標記

Fig.4 SSR markers amplified from the four gene pools

3 討 論

黃碧光等[4]發(fā)現， Prbs的分枝穗著生在中部1～3個穗軸節(jié)上，具有1～3個分枝穗軸節(jié)。馮宗云等[2]發(fā)現，F151的分枝穗著生在中部1～2個穗軸節(jié)上，具有1～2個分枝穗軸節(jié)。與 Prbs等穗分枝突變體相比，本研究發(fā)現，Ynbs-1的分枝穗長度、分枝穗數和分枝穗軸節(jié)數的均值分別達到了1.48±0.09 cm、23.56±1.52個和1.32±0.63個，分枝穗長度變化不大，但其大多數主穗軸節(jié)上都著生有分枝穗、具有分枝穗較多的特性。

馮宗云等[2,9]利用F2群體單株突變性狀與野生型性狀的分離比、結合F3株系的性狀分離特性，證明了控制F151、 Prbs的穗分枝性狀受1對核基因控制。通過對正、反雜交F1及其F2、F3群體的穗分枝遺傳分析，本研究發(fā)現，Ynbs-1突變體的穗分枝性狀受1對隱性核基因控制，該結果與馮宗云等[2,9]的報道基本一致。

與 Prbs和F151相比，Ynbs-1株系具有明顯不同的穗部特性，如小穗退化、單花小穗增多和結實率下降[3-5]、以及分枝穗較多等( 圖1F)。但上述差異特性不能有效證明Ynbs-1株系的穗分枝基因與 Prbs等突變體的是否等位。利用矮128突變體與不同的小麥矮桿突變體雜交， 通過F1植株株高分析和雜交親本間SSR標記的連鎖分析，張祥池等[24]發(fā)現矮128突變體攜帶的矮桿基因與Rht8、Rht9和Rht13等矮桿基因不等位。 本研究通過Ynbs-1與 Prbs的雜交F1植株的穗分枝特性分析、結合3個SSR標記和穗軸毛標記在雜交親本等材料間的連鎖分析，證明了Ynbs-1株系的穗分枝基因與 Prbs等3個突變體的不等位，是一個新的穗分枝基因。

到目前為止，大麥幼穗發(fā)育遺傳相關研究大多以三聯小穗育性為主，并涉及控制三聯小穗中單花小穗育性的一些基因及其功能[11-17,20-21]，但大麥三聯小穗發(fā)育的遺傳機制還有待深入研究。尚 毅等[10]和彭 澎等[25]發(fā)現， Prbs、Ynbs株系(包括Ynbs-1)的穗分枝原基分化與三聯小穗等大麥花器原基分化相關聯，且Prbs與Vrs1可能是等位基因[23]。沈真輝等[5]發(fā)現，Ynbs株系的穗分枝與多聯小穗退化、單花小穗增多和結實率下降等特性具有關聯性。本研究發(fā)現了Ynbs-1株系穗分枝基因數目、顯隱性和質核屬性等基本特性，該結果有助于深入研究Ynbs突變體的分枝穗、多聯小穗退化和單花小穗育性等性狀的遺傳機制。