侯丞志，汪 輝，吳 豪，錢 可，鄭文寅，張文明，郭文善，姚大年

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，安徽合肥 230036；2.江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州大學(xué)，江蘇揚州 225009)

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪饕娜蠹Z食作物之一。麥醇溶蛋白存在于小麥的胚乳中，占胚乳蛋白的40%左右，與麥谷蛋白合稱為小麥的貯藏蛋白;麥谷蛋白和醇溶蛋白共同形成面筋，兩者的含量和比例直接影響面團(tuán)的黏彈性與延展性[1]。麥醇溶蛋白在組成上的高度復(fù)雜性和對小麥品質(zhì)性狀的重要作用而受到廣泛關(guān)注[2]。

通過酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)可以將醇溶蛋白分離出15～30個譜帶，這些譜帶根據(jù)其在電泳圖譜上相對遷移率的大小可以分為α、β、γ、ω四種類型[3]；它們分別占醇溶蛋白總量的25%、30%、30%、15%[2]。不同小麥品種的醇溶蛋白譜帶的組成存在高度多態(tài)性，可以作為遺傳標(biāo)記用來進(jìn)行品種純度鑒定以及后代選擇等。醇溶蛋白主要受位于第1和第6同源染色體短臂上的多基因位點控制，分別被稱為Gli-1位點和Gli-2位點[4]。γ、ω醇溶蛋白主要由Gli-1位點控制，α、β醇溶蛋白主要由Gli-2位點控制[5]。

有關(guān)麥谷蛋白與小麥品質(zhì)間的研究已有較多報道，關(guān)于醇溶蛋白與小麥品質(zhì)性狀的關(guān)系研究較少[6]。閻旭東等[7]發(fā)現(xiàn)，譜帶為Gli42.3、62.7、39.6(2)、11.4和23.0等的醇溶蛋白對以沉降值為代表的面包烘烤品質(zhì)起正向作用。γ-44.5和γ-45.0對面條的加工品質(zhì)具有正向效應(yīng)，而γ-41.0對面條加工品質(zhì)則有負(fù)向效應(yīng)。Branlard等[8]發(fā)現(xiàn)，譜帶為α-72.5、74.0、76.0、84.0的醇溶蛋白對小麥面筋的膨脹性、彈性、延展性以及黏性具有正向作用。

本研究利用A-PAGE技術(shù)對安徽省種植的137份小麥品種進(jìn)行醇溶蛋白分離，通過不同品種、不同譜帶數(shù)量以及組成分析研究其遺傳多樣性，構(gòu)建小麥品種指紋圖譜[9]，同時利用醇溶蛋白電泳譜帶，研究蛋白質(zhì)亞基與小麥品質(zhì)之間的關(guān)系，以期為小麥品質(zhì)育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為安徽省種植的137份小麥品種(表1)，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥品質(zhì)育種實驗室提供。以中國春、Marquis(加拿大)、Neepawa(加拿大)為醇溶蛋白對照品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 醇溶蛋白分離方法

在1986年國際種子檢測協(xié)會(ISTA)頒布的小麥醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)程序的基礎(chǔ)上，結(jié)合郝小燕等[10]的方法進(jìn)行改進(jìn)。

醇溶蛋白提?。喝瘟７N子用單粒磨粉機磨碎，放入1.5 mL離心管中，按1 mg加5 μL 的比例加入提取液，室溫過夜；5 500 r·min-1離心15 min，取其上清液備用。

凝膠制備：取30 mL凝膠液加入3滴0.06%的過氧化氫制膠，靜置30 min后點樣。每個樣品孔點樣6 μL。20 ℃、500 V電泳1.5 h左右。5 mL 1%的考馬斯亮藍(lán)染液中加入100 mL 10%的三氯醋酸液配成染色液；染色過夜。純水或7%的乙酸溶液漂洗脫色；拍照保存。

1.2.2 醇溶蛋白電泳譜帶命名

利用中國春遷移率分別為24.0、50.0、79.0的三條譜帶為對照，計算137個品種的相對遷移率。利用原中國農(nóng)科院作物品種資源研究所計算機室與浙江大學(xué)合作編寫的Gel 2.0軟件進(jìn)行譜帶統(tǒng)計與分析。

1.2.3 小麥品質(zhì)性狀的測定

小麥面粉白度值使用日本R457型色差儀測定面粉的亮度L*值、紅度a*值和黃度b*值，進(jìn)而換算出白度值。

濕面筋含量使用瑞典Perten GM 2200參照AACC 38-12.02方法測定。

降落值使用瑞典Perten FN1900型降落數(shù)值儀參照AACC 56-81.03方法測定。

利用丹麥FOSS 1241型近紅外分析儀測定小麥籽粒的蛋白質(zhì)和淀粉含量。

利用德國Brabender Farinograph-E 型粉質(zhì)儀測定面團(tuán)流變學(xué)特性，包括面粉的吸水率、形成時間、穩(wěn)定時間、弱化度和粉質(zhì)指數(shù)等。具體操作參照AACC 54-21.02。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

供試材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)和遺傳距離(GD)利用Nei[11]的方法計算。利用UPGMA統(tǒng)計和完成聚類分析。利用DPS軟件對小麥醇溶蛋白條帶與小麥品質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料的醇溶蛋白

由表1可見，在137份安徽省種植小麥品種中，共分離出2 690條醇溶蛋白譜帶，平均每個品種19.63條譜帶，遷移率不同的譜帶類型共96種。而條帶最多的達(dá)到了28條，分別是恒進(jìn)麥6號、良星77、良星99和淮麥22，條帶最少的品種是豫農(nóng)035，僅有12條譜帶。由表2可見，在96種遷移率不同的條帶中，出現(xiàn)頻率最高的條帶是ω-14.3，共出現(xiàn)了108次，出現(xiàn)頻率為77.70%。出現(xiàn)頻率最低的是α-81.7和α-89.3，均出現(xiàn)1次，頻率為0.72%。說明不同小麥品種間醇溶蛋白的數(shù)量和組成具有豐富的多態(tài)性。

2.2 醇溶蛋白遺傳距離分析以及聚類分析

137份供試材料共得出9 316個醇溶蛋白遺傳相似系數(shù)(GS),據(jù)此來計算相應(yīng)的遺傳距離。

表1 137個品種醇溶蛋白條帶數(shù)Table 1 Number of gliadin bands of 137 varieties

表2 不同醇溶蛋白電泳譜帶在供試材料中出現(xiàn)的頻率Table 2 Frequency of different gliadin electrophoresis bands in the tested materials

供試材料的遺傳距離變異范圍在0.13～0.81，平均值為0.70。遺傳距離最大的是存麥8號與鎮(zhèn)麥11，說明兩個材料親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。遺傳距離最小的是谷神6號與淮麥29，說明兩個材料親緣關(guān)系較近。而通過UPGMA法對供試品種間遺傳距離進(jìn)行聚類分析(圖2)發(fā)現(xiàn)，137個品種在GD值為0.70時被分為7類。第一類共84個材料，分為5個亞類，第1亞類包含22個材料，第2亞類包含21個材料，第3亞類包含23個材料，第4亞類包含10個材料，第5亞類包含8個材料。第二類包含17個材料。第三類包含7個材料。第四類包含5個材料。第五類包含17個材料。第六類包含5個材料。第七類包含2個材料。

2.3 醇溶蛋白對小麥理化性狀的影響

96種不同遷移率的醇溶蛋白中，有34種譜帶與69項次小麥理化品質(zhì)之間的相關(guān)性達(dá)到了顯著或極顯著水平。通過表3可以發(fā)現(xiàn)，遷移率為43.3和73.4的醇溶蛋白對小麥面粉色澤L*值和小麥面粉白度值具有顯著正向的作用。遷移率為37.9的醇溶蛋白與小麥面粉色澤b*值呈顯著正相關(guān)，與L*值和小麥面粉白度值呈顯著負(fù)相關(guān)。遷移率為14.3、22.2和65.8的醇溶蛋白與小麥面粉色澤a*值呈顯著負(fù)相關(guān)。遷移率為18.7、21.3、46.1、55.8的醇溶蛋白與小麥淀粉含量顯著顯著正相關(guān)。遷移率為14.3、18.0、18.7、22.2、55.8的醇溶蛋白與小麥蛋白質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)。而遷移率為21.3、23.6、27.6和46.1的醇溶蛋白與小麥蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)。

因此，在今后的小麥品質(zhì)育種中可以加強對遷移率為21.3、23.6、27.6、46.1和73.4的醇溶蛋白的篩選，盡量避免遷移率為14.3、18.0、22.2的醇溶蛋白應(yīng)用。

C:中國春；1：恒進(jìn)麥6號；2：益科5號；3：恒進(jìn)麥8號；4：淮麥24；5：紅皖88；6：連麥6號；7：國盛麥1號；8：安農(nóng)大1216；9：中育1123；10：新麥26；11：皖墾麥869；12：鑫麥8號；13：泛麥5號；14：徐麥33；15：濮興5號。

C:Chinese Spring；1:Hengjinmai 6；2:Yike 5；3:Hengjinmai 8；4:Huaimai 24；5:Hongwan 88；6:Lianmai 6；7:Guoshengmai 1； 8:Anhongda 1216；9:Zhongyu 1123；10:Xinmai 26；11:Wankenmai 869；12:Xinmai 8；13:Fanmai 5；14:Xumai 33；15:Puxing 5.

圖1 部分供試品種醇溶蛋白電泳圖

Fig.1 Picture of some tested varieties

2.4 醇溶蛋白對面粉粉質(zhì)特性和面筋指標(biāo)的影響

96種不同遷移率的醇溶蛋白中，有45種與79項次小麥面粉粉質(zhì)特性和面筋指標(biāo)之間的相關(guān)性達(dá)到了顯著或極顯著水平。通過表4可以發(fā)現(xiàn)，遷移率為9.7、37.1、57.3的醇溶蛋白與面團(tuán)穩(wěn)定時間呈顯著正相關(guān)。遷移率為68的醇溶蛋白與粉質(zhì)指數(shù)和面筋指數(shù)呈顯著正相關(guān)。遷移率為57.3、62.4、67.3的醇溶蛋白與面團(tuán)形成時間呈顯著正相關(guān)。遷移率為21.3、23.6、42.7、43.3、80.1的醇溶蛋白與濕面筋含量呈顯著正相關(guān)。遷移率為21.3、23.6、43.3、68.0、70.5的醇溶蛋白與面筋指數(shù)呈顯著正相關(guān)。遷移率為76.8的醇溶蛋白與弱化度正相關(guān)。遷移率為16.3和58.5的醇溶蛋白與降落值呈顯著正相關(guān)。遷移率為37.1和73.4的醇溶蛋白與吸水率呈顯著負(fù)相關(guān)。遷移率為14.3、18.0、18.7、20.5、22.2的醇溶蛋白與濕面筋含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

推測遷移率為21.3、23.6、43.3的醇溶蛋白有利于增加面粉的濕面筋含量與面筋指數(shù)；遷移率為9.7、37.1、57.3、62.4、67.3的醇溶蛋白會提高面粉的面團(tuán)穩(wěn)定時間以及形成時間，對于強筋小麥品質(zhì)育種具有幫助。而遷移率為14.3、18.0、18.7、20.5、22.2、43.8、69.4和76.8的醇溶蛋白有利于弱筋或中筋小麥品質(zhì)育種。

3 討 論

3.1 醇溶蛋白的多態(tài)性

通過對137個安徽省種植小麥品種的醇溶蛋白分離，發(fā)現(xiàn)在137個品種的醇溶蛋白圖譜中，條帶的組成和數(shù)量具有高度的多態(tài)性；供試材料的醇溶蛋白譜帶為12～28。其中條帶總數(shù)出現(xiàn)次數(shù)最多的是20條，占總體的13.8%。而在α區(qū)條帶數(shù)量最多為6條，最少為1條。β區(qū)最多為7條，最少為3條。ω區(qū)最多為13條，最少為2條。γ區(qū)最多為7條，最少為1條。由此可見，安徽省種植小麥品種具有豐富的多態(tài)性，而利用這種多態(tài)性，可以將醇溶蛋白作為小麥種子純度鑒定以及后代選擇的依據(jù)之一。

3.2 醇溶蛋白的遺傳多樣性

通過對137個安徽省種植小麥品種的醇溶蛋白組分進(jìn)行分析，供試材料的GD值變異范圍為0.13～0.81，說明供試材料中存在著豐富的遺傳多樣性，可作為小麥遺傳改良的重要資源。供試材料在GD=0.73時可分為7類，大部分親緣關(guān)系較近的材料被分在一類，但也有個別親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種聚類較近，可能是因為在品種選育過程中，醇溶蛋白的編碼基因發(fā)生了重組或者是育種家的選擇傾向，導(dǎo)致了醇溶蛋白編碼基因位點產(chǎn)生了遺傳變異[12]。

表3 部分醇溶蛋白遷移率與小麥理化品質(zhì)的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients between the migration rate of some gliadin bands and the physicochemical quality of wheat

*：P<0.05；**：P<0.01.

圖2 137個品種醇溶蛋白聚類圖

遷移率Rf粉質(zhì)參數(shù) Farinograph characteristic吸水率WA形成時間DT穩(wěn)定時間ST粉質(zhì)指數(shù)FQN弱化度SD面筋指數(shù)GI降落值FN濕面筋WG9.7-0.540.850.96??0.95?-0.820.820.70-0.5614.3-0.20?0.010.090.010.010.130.10-0.36??16.3-0.110.150.23?0.210.010.140.31??-0.1917.0-0.130.010.100.07-0.120.35?-0.42?-0.2918.0-0.320.170.280.09-0.13-0.55??0.19-0.1118.7-0.280.140.17-0.12-0.18-0.76??0.440.0420.5-0.230.110.150.03-0.14-0.38??0.240.1021.3-0.150.080.210.220.140.45??-0.39?0.44??22.2-0.10-0.09-0.22-0.120.070.26-0.24-0.40??22.8-0.290.060.18-0.06-0.040.41?0.04-0.48??23.6-0.240.040.110.13-0.040.34?-0.140.35?24.8-0.18-0.34-0.20-0.41?0.24-0.13-0.12-0.3625.6-0.200.120.34?0.15-0.30?0.08-0.12-0.33?27.6-0.29?-0.040.160.16-0.15-0.200.16-0.1228.5-0.040.040.090.030.040.20-0.150.34?29.3-0.210.010.04-0.07-0.02-0.36?0.130.0231.4-0.34?0.140.030.020.05-0.180.18-0.1732.20.160.200.100.160.09-0.090.15-0.56?32.7-0.02-0.210.10-0.59?0.03-0.23-0.06-0.1936.10.030.680.500.55-0.29-0.240.600.80?37.1-0.67??-0.130.62??0.53?-0.110.50?-0.50?-0.51?38.50.180.080.120.05-0.16-0.280.37?0.0842.7-0.380.470.64?0.60-0.480.400.220.74??43.3-0.330.010.42?0.16-0.300.41?-0.100.61??43.80.29-0.21-0.15-0.300.210.18-0.63?-0.5144.4-0.210.070.170.08-0.12-0.29?0.02-0.2346.1-0.230.21-0.04-0.090.01-0.29?0.12-0.2051.50.110.280.38?0.33?-0.20-0.010.15-0.1154.1-0.41?0.150.150.16-0.23-0.42?0.040.1654.9-0.37-0.15-0.02-0.180.09-0.46?0.40-0.3857.30.010.32?0.40??0.32?-0.260.060.24-0.1258.5-0.130.090.130.13-0.070.070.36??-0.0759.2-0.51-0.43-0.18-0.220.230.43-0.71?-0.5362.4-0.190.39?0.41?0.39?-0.260.180.09-0.3363.2-0.39?-0.34-0.16-0.220.15-0.24-0.10-0.0566.5-0.58?0.020.05-0.09-0.04-0.210.260.0368.00.010.48?0.46?0.53??-0.100.58??-0.16-0.3568.7-0.27-0.010.19-0.27-0.27-0.55?-0.07-0.2669.4-0.34-0.20-0.11-0.220.360.06-0.45?0.0870.5-0.300.170.44?0.44?-0.350.52??0.16-0.44?73.4-0.60??-0.020.220.19-0.010.230.12-0.43?76.00.53-0.32-0.36-0.250.180.28-0.47-0.69?76.8-0.10-0.36-0.47-0.48?0.65??-0.52?0.20-0.1180.10.42-0.08-0.13-0.170.21-0.110.370.73??86.1-0.96?-0.370.810.850.21-0.680.99?0.57

*：P<0.05；**：P<0.01.WA:Water absorption；DT:Development time；ST:Stability time；FQN:Farinograph quality number；SD:Degree of softening；GI:Gluten index；FN:Falling number；WG:Wet gluten.

3.3 醇溶蛋白與品質(zhì)性狀的相關(guān)性

本研究中，遷移率為21.3和23.6的醇溶蛋白與小麥蛋白質(zhì)含量、小麥濕面筋含量和面筋指數(shù)具有一定的正相關(guān)關(guān)系。遷移率為43.3的醇溶蛋白與小麥面粉色澤L*值和白度值呈顯著的正相關(guān)，而且能提高小麥面團(tuán)濕面筋含量和面筋指數(shù)。

F.G.Kosmolak 等[13]發(fā)現(xiàn)，硬粒小麥中醇溶蛋白γ-45和γ-42與面筋品質(zhì)顯著相關(guān)，含有γ-45的品種具有較好的面筋品質(zhì)，但含有γ-42的品種面筋品質(zhì)較差。王曙光等[14]研究表明，Gli19.1與蛋白質(zhì)和濕面筋含量呈顯著正相關(guān)，Gli16.5、Gli58.6、Gli69.4與降落值呈顯著或極顯著正相關(guān)。本研究供試品種中并未出現(xiàn)上述醇溶蛋白，說明不同品種間醇溶蛋白亞基的組成存在著巨大差異。

研究表明，醇溶蛋白與小麥的品質(zhì)性狀具有一定的關(guān)系[15]，但是具體的醇溶蛋白與小麥的品質(zhì)性狀的關(guān)系還缺乏一致性的結(jié)論。有可能是因為麥醇溶蛋白是由多個基因位點控制的單體蛋白。有研究得出，醇溶蛋白在Gli-1的等位基因變異對面團(tuán)品質(zhì)的影響應(yīng)歸結(jié)為Gli-1位點和低分子量谷蛋白Glu-3位點的緊密連鎖，而Glu-3位點對于小麥面團(tuán)品質(zhì)的影響已經(jīng)得到證實[16]。建議在研究醇溶蛋白與品質(zhì)性狀之間的關(guān)系時，要考慮到醇溶蛋白與麥谷蛋白之間的相互作用，這樣可以更快的篩選出醇溶蛋白的優(yōu)質(zhì)基因，有利于加快小麥品質(zhì)育種進(jìn)程。