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內(nèi)皮素-1基因多態(tài)性與腦出血的關(guān)系及其對血壓的影響☆

2019-06-14 07:38:58易袁晶魏雪利馬明明
中國神經(jīng)精神疾病雜志 2019年5期
關(guān)鍵詞:多態(tài)基因型位點

易袁晶 魏雪利 馬明明

劉寶瓊△ 胡治平** 肖波△ 曾藝*○☆

研究發(fā)現(xiàn)長沙地區(qū)腦出血年平均發(fā)病率為131.0/10萬,腦出血占腦卒中的比例為55.4%,遠(yuǎn)高于世界平均水平,其中79.8%腦出血患者患有高血壓病[1]。在長沙漢族人群研究中,證實遺傳因素與腦出血發(fā)病有關(guān)[2-4]。近期研究表明,腦出血急性期人體ET-1血漿水平升高,且與顱內(nèi)血腫大小成正相關(guān)[5],提示ET-1可能參與腦出血的發(fā)病。ET-1基因單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphisms,SNPs)已被證實參與了包括高血壓、動脈粥樣硬化在內(nèi)的多種人體疾病發(fā)生、發(fā)展的病理過程[6]。本研究擬利用長沙漢族人群研究ET-1基因兩個常見 SNPs(rs5370、rs1800541)與腦出血的關(guān)系,并探討對其血壓的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2006年1月至2009年12月于湘雅醫(yī)院就診的腦出血患者作為研究對象,收集其臨床資料和外周血標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥18歲;②湖南省長沙地區(qū)漢族人;③頭顱CT平掃和/或頭顱MRI平掃證實為急性腦出血,且符合第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];④發(fā)病至住院時間≥14 d。排除標(biāo)準(zhǔn):①外傷、藥物、動脈炎、腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤引起的腦出血病例;②混合型腦血管?。üK篮蟪鲅虺鲅蠊K溃┑牟±虎鄹文I功能障礙、血液病及溶栓治療接受者、甲狀腺疾病、自身免疫型疾病及妊娠者。

隨機(jī)選取同期在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院的健康體檢人員作為對照組,收集其臨床資料和外周血標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥18歲;②湖南省長沙地區(qū)漢族人。排除標(biāo)準(zhǔn):①腦血管病、血液病、肝腎疾病、甲狀腺疾病、自身免疫性疾病、及妊娠者;②無腦血管病家族史。

腦出血組、對照組成員均無血緣關(guān)系,并簽署知情同意書。研究方案通過醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 血清標(biāo)本的采集研究對象禁食12 h,次日清晨7時至 8時采外周靜脈血 10 mL,取 5 mL(不抗凝)靜置 1 h,2000 r/min常溫離心后分離血清,將血清置于4℃冰箱保存,用于血脂測定,其余5 mL(肝素抗凝)用于DNA制備。

1.3 收縮壓、舒張壓和平均動脈壓的測定測量腦出血患者入院時、發(fā)病1周后和發(fā)病2周后血壓,3次血壓均超過140 mmHg/90 mmHg、發(fā)病之前確診過高血壓病或者口服高血壓藥物者診斷為臨床高血壓病。將腦水腫高峰期前或者高峰期過后的血壓水平進(jìn)行記錄。

1.4 基因分型利用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。用于擴(kuò)增ET-1基因兩個SNPs位點的PCR引物序列經(jīng)Primer 3.0設(shè)計,由上海生工公司合成。引物序列:rs5370F AAGAGTTGCGGCGGGTGGT,rs5370R AATGTGCTCGGTTGTGGGTCA;rs1800541F GGCATCCCCTGGGAAGAGA CT,rs1800541R TGCATGGAACACATTGGCTTTT。 PCR 反應(yīng)條件:96 ℃預(yù)變性 15 min;96 ℃ 10 s,50℃ 5 s,60 ℃ 30 s,28個循環(huán);60℃延伸1 min。根據(jù)美國ABI公司的操作說明采用SAP/ExoⅠ酶法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。根據(jù)SNP上游序列,使用Primer 3.0設(shè)計ET-1基因兩個SNPs位點的單堿基延伸引物。延伸引物序列:rs5370SF TTTTATCCCAAGCTGAAAGGCAA,rs1800541SR TTTTTTTTTTTTTGA ATTTTTGTTTGTTCTCCACCA。延伸反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性1 min;96℃變性 10 s,50℃退火 5 s,60 ℃延伸 30 s,28個循環(huán);60℃延伸1 min。延伸產(chǎn)物純化:在10 μL延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶,37℃溫浴 1 h,然后75℃滅活15 min。純化后的延伸產(chǎn)物在ABI 3130XL測序儀上樣。收集ABI 3130XL測序儀上的原始數(shù)據(jù),用GeneMapper 4.0進(jìn)行SNP信息分析。選取有代表性的樣本對每種基因型測序,在SNP數(shù)據(jù)庫中對測序結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計,按Hardy-Weinberg平衡法檢驗群體代表性。對腦出血與正常對照組兩組間基因型和等位基因的頻率比較采用χ2檢驗,血壓水平和不同基因型亞組間血壓比較采用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況共納入腦出血患者195例,男133例,女62

例,平均(55.40±11.21)歲;對照組 116例,男 41例,女 75例,平均(54.97±10.41)歲。兩組在年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙史方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。腦出血組冠心病史、高血壓病史和糖尿病史均高于對照組(P<0.05)。血壓水平比較,腦出血組的平均動脈壓顯著高于對照組(P<0.05)。血脂水平比較,腦出血組甘油三脂和高密度脂蛋白膽固醇水平(HDL-C)顯著低于對照組(P<0.05)。

2.2ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)分布116例健康對照中,成功分型出114例,陽性檢出率>95%。各SNPs的基因型及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。研究發(fā)現(xiàn)長沙地區(qū)漢族人群中,ET-1基因rs5370多態(tài)有GG、GT、TT三種基因型,ET-1基因rs1800541多態(tài)有 TT、TG、GG三種基因型。選取具代表性樣本進(jìn)行直接測序,各位點基因型全部與測序結(jié)果吻合見(圖1)。通過查詢http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中 dbSNP, 我們ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)的基因型及等位基因頻率及與其他人群比較結(jié)果見表 1、2,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)與腦出血的關(guān)系本研究195例腦出血患者中,成功分型出194例,陽性檢出率>95%。腦出血組與對照組的ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)基因型及等位基因頻率比較見表3。腦出血組與對照組ET-1基因rs5370、rs1800541基因型及等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)性與腦出血的易感性之間無明顯相關(guān)性。

2.4ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)對血壓的影響腦出血組與對照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)不同基因型對收縮壓 (systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)和平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)的影響見表4。腦出血組及對照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)各基因型亞組間 SBP、DBP和 MAP水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

3 討論

內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)是內(nèi)皮素家族的主要成員,也是人體內(nèi)內(nèi)皮素的主要存在形式,主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌[8],能通過長程收縮血管導(dǎo)致血壓升高,現(xiàn)已被認(rèn)為是高血壓的一個重要危險因素[6]。高血壓是腦出血的主要病因。趙永波等[9]發(fā)現(xiàn)ET-1可能為高血壓及高血壓性腦出血的共同危險因素,并參與、影響高血壓性腦出血的病理生理過程。武婕等[10]研究表明血漿ET水平的升高程度與腦出血量有一定關(guān)系。ET-1的血漿水平及其生物學(xué)活性均主要由ET-1基因調(diào)控[6]。

表1正常對照人群中rs5370多態(tài)分布及其他人群比較

圖1 ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)基因分型結(jié)果與測序圖。A~C為 ET-1基因rs5370多態(tài)位點的基因分型結(jié)果,分別代表GG、TT、GT基因型;D~F為 ET-1基因 rs1800541多態(tài)位點的基因分型結(jié)果,分別代表 TT、GG、TG基因型;G~I(xiàn)為 ET-1基因rs5370多態(tài)位點正向測序圖,分別代表GG、GT、TT基因型;J~L為 ET-1基因rs1800541多態(tài)位點反向測序圖,分別代表TT、TG、GG基因型

表2正常對照人群中rs1800541多態(tài)分布及其他人群比較

表4 腦出血組與對照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)對血壓的影響

ET-1基因rs5370多態(tài)一直是ET-1基因與疾病研究的主要目標(biāo)多態(tài)位點[11]。既往研究表明,ET-1基因rs5370等多態(tài)與普通人群高血壓病無關(guān),僅與某些特殊人群(如肥胖患者、孕婦等)中的高血壓相相關(guān)[12-14]。有關(guān)rs5370與腦出血的相關(guān)性尚未見報導(dǎo)。PANOULAS等[15]發(fā)現(xiàn)ET-1基因rs1800541與rs5370多態(tài)構(gòu)成的單倍體(T-T)與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者ET-1血漿水平增高及其罹患高血壓 (舒張壓升高為主)的風(fēng)險增高有關(guān)。因此,我們的研究特意選擇了ET-1基因rs5370多態(tài)及與rs5370多態(tài)在同一染色體上并位置鄰近的ET-1基因rs1800541多態(tài)作為候選位點。研究結(jié)果顯示長沙地區(qū)漢族人群中,腦出血ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)基因型及等位基因頻率分布與對照組比較均無顯著性差異,提示ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)可能與腦出血的發(fā)病無關(guān)。我們加做了其單體型與腦出血的關(guān)系研究,但仍未得到陽性發(fā)現(xiàn)。

本研究顯示對照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)基因型亞組間的血壓水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),與既往研究結(jié)果相符。本研究顯示腦出血組的平均動脈壓顯著高于對照組 (P<0.05),但腦出血組ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)基因型亞組間的血壓水平無顯著性差異(P>0.05), 提示ET-1基因 rs5370、rs1800541 多態(tài)可能不是影響腦出血患者血壓水平的重要因素。

綜上所述,在長沙漢族人群中,采用病例-對照法對ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)與腦出血的關(guān)系進(jìn)行研究,結(jié)果提示ET-1基因rs5370、rs1800541單核苷酸多態(tài)可能與腦出血的發(fā)病無關(guān),并可能不是影響其血壓水平的重要因素。但腦出血是一種多基因復(fù)雜性狀疾病,其遺傳模式復(fù)雜、未知,加上遺傳異質(zhì)性、表型異質(zhì)性及各種環(huán)境因素的影響,仍須在不同種族、地域人群中進(jìn)行更大樣本量的研究,以進(jìn)一步明確ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)與腦出血的關(guān)系。

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