楊 潮，何小楊，莫淑芳，戴 京，張欣宇，陳 慧

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人基因啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

楊 潮，何小楊，莫淑芳，戴 京，張欣宇，*陳 慧

(贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，贛州 341000 )

人是一種重要的支架蛋白，在端粒酶組裝、卡哈爾體（Cahar body）形成和DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用。采用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得人WDR79基因啟動(dòng)子上游DNA序列，構(gòu)建人基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3--promoter；通過雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳、DNA測序和熒光素酶活性測定等實(shí)驗(yàn)手段，驗(yàn)證質(zhì)粒pGL3--promoter構(gòu)建的正確性及其表達(dá)活性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討人基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

；啟動(dòng)子克隆；熒光素酶活性檢測

（WD repeat-containing protein 79）蛋白，又被稱為WRAP53或TCAB1，隸屬于WD重復(fù)蛋白家族，編碼該蛋白的基因定位于人染色體17p13.1，與人抑癌基因以“頭對頭”的方式重疊。基因由13個(gè)外顯子組成，其中包含了3個(gè)可選的起始外顯子1-α，1-β和1-γ，編碼的蛋白產(chǎn)物由548個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量約為59 kD[1]。作為卡哈爾體重要組成成分的蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，可為蛋白質(zhì)和RNA復(fù)合物的裝配提供平臺，在蛋白質(zhì)運(yùn)輸、RNA加工及轉(zhuǎn)錄以及DNA損傷修復(fù)等生理過程中發(fā)揮著重要功能[2-3]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)在頭頸癌、直腸癌、乳腺癌和肺癌等多種癌癥中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與癌癥病人的預(yù)后相關(guān)[4-5]，然而迄今對的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未明確。為此，本研究通過克隆人基因啟動(dòng)子，構(gòu)建人啟動(dòng)子熒光素酶表達(dá)載體，并對其活性進(jìn)行驗(yàn)證，為進(jìn)一步探討人基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞購自中科院典藏細(xì)胞庫，質(zhì)粒pGL3-Basic和pRL-TK為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

Marker C和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒等購自于上海生工生物工程股份有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、基因組DNA小量抽提試劑盒和PCR純化試劑盒/DNA純化試劑盒等均購自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PrimeSTAR Max DNA Polymerase（2×）、限制性內(nèi)切酶和、4DNA 連接酶、感受態(tài)細(xì)胞5α購自大連寶生物工程有限公司；Lipofectamine 3000購自 Invitrogen 公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自 Gibco 公司；引物合成和質(zhì)粒測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

5430R型冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；HH-2型水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；pro Flex型PCR擴(kuò)增儀（美國Applied Biosystems公司）；微波爐（廣東美的廚房電器制造有限公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；恒溫振蕩搖床（常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（南京馳順專業(yè)凝膠電泳儀制造商）；SW-CJ-2G型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人基因組DNA提取

收集對數(shù)生長期的人胚腎細(xì)胞 293T，用基因組DNA小量抽提試劑盒提取基因組總DNA，作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。該實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照上海碧云天生物技術(shù)有限公司的基因組DNA小量抽提試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 人基因啟動(dòng)子表達(dá)載體pGL3--promoter構(gòu)建及鑒定

針對的啟動(dòng)子序列和質(zhì)粒pGL3-Basic的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成PCR擴(kuò)增引物（如表1）。以人基因組DNA模板，以表1中引物擴(kuò)增人基因5'側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)650 bp的DNA序列，擴(kuò)增PCR片段經(jīng)酶切、純化后，與質(zhì)粒pGL3-Basic按照1:5的摩爾比例在T連接酶的作用下進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒小提后，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶和雙酶切鑒定，同時(shí)將重組后的質(zhì)粒進(jìn)行測序分析（上海生工），以證實(shí)其正確性。

表1 人WDR79啟動(dòng)子擴(kuò)增引物序列

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

人胚腎細(xì)胞株293T細(xì)胞放置于5% CO2和37℃條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10% FBS的DMEM。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，進(jìn)行分盤，以毎孔 2×105個(gè)細(xì)胞分入六孔板中，然后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。依照脂質(zhì)體使用說明書將對照質(zhì)粒pGL3-Basic和重組質(zhì)粒pGL3-- promoter分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRT-TK、脂質(zhì)體按比例孵育后，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，待細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行熒光素酶實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 熒光素酶實(shí)驗(yàn)

在兩組不同處理的細(xì)胞中分別加入250 μL 裂解液，于搖床上劇烈搖蕩 20 min，待細(xì)胞裂解成絲狀物移入 EP 管中收集，12, 000 rpm 離心30 s，取上清轉(zhuǎn)入新的 EP 管中，置冰上按照熒光素酶試劑盒說明進(jìn)行檢測。記錄樣本中實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒攜帶的螢火蟲熒光素酶激發(fā)底物釋放熒光的數(shù)值即為(M1)和內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK攜帶的水母熒光素酶激發(fā)底物釋放熒光的數(shù)值(M2)。以Ml/M2比值表征重組質(zhì)粒相對的表達(dá)活性，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。將所獲得的數(shù)據(jù)輸入 Excel 表格中進(jìn)行分析，然后用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算各組樣本的差異，做成柱狀圖。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，統(tǒng)計(jì)不同樣本間的差別。圖中的星號表示用函數(shù)TTEST算出來的值。*< 0.05，**≤ 0.01，***≤ 0.001。值小于0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增人WDR79基因啟動(dòng)子

以人基因組 DNA 為模板，利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增人基因 5'側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū) 650 bp 的 DNA 序列，加上引物上的保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)，PCR 產(chǎn)物的全長為 672 bp，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到的 PCR 產(chǎn)物的片段大小與預(yù)期值相符(圖 1)。

M：Marker C 1: PCR 產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒pGL3-WDR79-promoter的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的基因啟動(dòng)子的DNA片段與質(zhì)粒pGL3-Basic按照濃度比為5：1的比例在T4 DNA連接酶作用下相連，成功構(gòu)建質(zhì)粒pGL3--promoter（如圖2）。

圖2 pGL3-WDR79-promoter重組質(zhì)粒圖譜

2.3 重組質(zhì)粒pGL3-WDR79-promoter雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒pGL3--promoter經(jīng)限制性內(nèi)切酶和雙酶切鑒定，被切割成 672 bp 和 4.8 kb 兩個(gè)DNA片段，酶切后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期相符（圖3）。DNA測序結(jié)果顯示擴(kuò)增的外源DNA片段已正確插入 pGL3-Basic 載體，堿基序列與 GenBank報(bào)道序列一致。

M：Marker C 1：低濃度的pGL3-WDR79-promoter 酶切片段2: 高濃度的pGL3-WDR79-promoter 酶切片段

2.4 質(zhì)粒pGL3-WDR79-promoter活性鑒定

重組質(zhì)粒pGL3--promoter和pGL3-Basic分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞后，采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)分析啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，pGL3--promoter組的熒光活性高于pGL3-Basic組約 6.4 倍，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）（圖 4）。

pGL3-Basic pGL3-WDR79-promoter （** P＜0.01）

3 討論

是 WD 重復(fù)蛋白家族成員之一，包含有六個(gè) WD 基元，在進(jìn)化中高度保守，是細(xì)胞核內(nèi)卡哈爾體形成必不可少的成份[6]。與人原發(fā)癌存在關(guān)聯(lián)性，在乳腺癌和卵巢癌中都存在相同的單核苷酸多態(tài)位置[7-8]。還被發(fā)現(xiàn)在多種人腫瘤細(xì)胞株中明顯高表達(dá)，在小鼠成纖維細(xì)胞 NIH3T3 中過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，而抑制的表達(dá)能通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且過表達(dá)與頭頸部腫瘤預(yù)后差密切相關(guān)[9]。在臨床多種癌癥組織中研究者發(fā)現(xiàn)存在有高表達(dá)并與預(yù)后相關(guān)，被認(rèn)為是癌癥診斷的生物標(biāo)志物[10]。在非小細(xì)胞肺癌中抑制表達(dá)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞通過線粒體信號途徑發(fā)生凋亡，癌細(xì)胞增殖和移植瘤的生長也能夠被有效抑制[11-12]。這些研究都表明參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，它是癌癥一個(gè)潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，自身被轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚。

本研究選取了人基因上游5′非翻譯區(qū)-2000 bp~100 bp的DNA序列作為分析對象，利用 JASPAR 網(wǎng)站分析該段序列上的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，克隆了人基因上游5′非翻譯區(qū)上游650 bp的DNA序列作為啟動(dòng)子，構(gòu)建了人啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒[13]。經(jīng)雙酶切和測序發(fā)現(xiàn)插入的DNA片段大小和序列順序與GeneBank序列一致，且插入方向無誤。為了驗(yàn)證質(zhì)粒pGL3--promoter活性，研究采用了熒光素酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了pGL3--promoter的細(xì)胞裂解液中熒光素酶信號比pGL3-Basic組高約 6.4 倍。綜上所述，本研究成功構(gòu)建了含人基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，為后續(xù)研究人基因啟動(dòng)子表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[1] Farnebo M. WRAP53 (WD repeat containing, antisense to TP53)[J]. Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haema-tology, 2011, 15(7): 596-597.

[2] Mahmoudi S, Henriksson S, Corcoran M, et al. Wrap53, a natural p53 antisense transcript required for p53 induction upon DNA damage[J]. Molecular Cell, 2009, 33(4): 462-471.

[3] Stirnimann C U, Petsalaki E, Russell R B, et al.proteins propel cellular networks[J]. Trends in Biochemical Sciences, 2010, 35(10): 565-574.

[4] Boscolorizzo P, Mosto M C D, Rampazzo E, et al. Telomeres and telomerase in head and neck squamous cell carcinoma: from pathogenesis to clinical implications[J]. Cancer Metastasis Reviews, 2016, 35(3): 457-474.

[5] Zhao T, Hu F, Qiao B, et al. Telomerase reverse transcriptase potentially promotes the progression of oral squamous cell carcinoma through induction of epithelial-mesenchymal transition[J]. International Journal of Oncology, 2015, 46(5): 2205-2215.

[6] Mahmoudi S, Henriksson S, Weibrecht I, et al. WRAP53 is essential for Cajal body formation and for targeting the survival of motor neuron complex to Cajal bodies [J]. PLoS biology, 2012, 8(11): 1000521.

[7] Garcia-Closas M, Kristensen V, Langerod A, et al. Common genetic variation in TP53 and its flanking genes,and ATP1B2, and susceptibility to breast cancer [J]. International journal of cancer Journal international du cancer, 2007, 121(11): 2532-2538.

[8] Schildkraut J M, Goode E L, Clyde M A, et al. Single nucleotide polymorphisms in the TP53 region and susceptibility to invasive epithelial ovarian cancer [J]. Cancer research, 2009, 69(6): 2349-2357.

[9] Mahmoudi S, Henriksson S, Farnebo L, et al. WRAP53 promotes cancer cell survival and is a potential target for cancer therapy [J]. Cell death & disease, 2011, 2(1): 114.

[10] Wang M J, Ping J, Li Y, et al. The prognostic factors and multiple biomarkers in young patients with colorectal cancer [J]. Scientific reports, 2015, 5(10645).

[11] Sun Y, Yang C, Chen J, et al. Overexpression of WDR79 in non-small cell lung cancer is linked to tumour progression [J]. Journal of cellular and molecular medicine, 2016, 20(4): 698-709.

[12] Hu Jian Yuan Ping, Wang Zhitian，et al. The Inhibitory Effect ofRNAi on the Proliferation of Human Lung Cancer A549 Cells [J]. Chinese Journal of Cell Biology, 2014, 36(10): 1382–1388.

[13] 熊偉,張曉娟,孫美濤,等. 人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子2基因啟動(dòng)子區(qū)的生物信息學(xué)分析[J]. 井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2016 , 37 (1) :51-56.

CONSTRUCTION AND IDENTIFICATION OF THE EXPRESSION VECTOR CONTAINING THE HUMANGENE PROMOTER

YANG Chao, HE Xiao-yang, MO Shu-fang, DAI Jing, ZHANG Xin-yu,*CHEN Hui

（College of Life Sciences, Gannan Normal University, Ganzhou, Jiangxi 34100, China）

, a scaffold protein, plays an critical role in telomerase assembly, Cahar body formation, and DNA damage repair. The upstream DNA sequence of humanpromoter was obtained by PCR amplification to construct the recombination vector pGL3-- promoter. The correctness and activity of the plasmid pGL3--promoter were verified by double enzyme cutting, agarose gel electrophoresis, DNA sequencing and luciferase assasies. The results of this study provide experimental basis for elucidating the mechanism ofgene expression.

; promoter cloning; activity assay of luciferase

1674-8085(2019)03-0031-04

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.03.006

2019-01-11；

2019-03-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81660491,81402304)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20161BAB215221)；贛南師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(15zb08)

楊 潮(1984-)，男，安徽巢湖人，講師，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病因?qū)W研究(Email：yac508@126.com);

何小楊(1995-)，男，江西贛州人，贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)2015級本科生(E-mail:342064335@qq.com);

莫淑芳(1996-)，女，湖南懷化人，贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)2018級本科生(E-mail:3038123801@qq.com);

戴 京(1994-)，男，江西撫州人，贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)2015級本科生(E-mail:3286380144@qq.com);

張欣宇(1996-)，女，內(nèi)蒙古赤峰人，贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)2015級本科生(E-mail:1796188233@qq.com);

*陳 慧(1985-)，女，江西贛州人，講師，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病因?qū)W研究(E-mail:chenhui0910102@163.com).