黃素瓊 侯英 王曉棟 李波 劉友平 魏嵋

1西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院（四川瀘州646000）；2西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院（四川瀘州646000）；3西南醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院（四川瀘州646000）

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）主要因長期大量飲酒引起，早期表現(xiàn)為脂肪肝，進而可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化及肝癌等［1-3］。ALD 在我國目前已是繼病毒性肝炎之后的第二大肝臟疾患，且目前西醫(yī)藥對ALD的逆轉(zhuǎn)治療效果不佳，這給個人、家庭及社會帶來了嚴重負擔［4-5］。近年來，本院著名全國名老中醫(yī)孫同郊根據(jù)瀘州地域特點，并結(jié)合大量的臨床經(jīng)驗，得出了藥食同源的專方——枳葛解酒方，目前已將該方制成濃縮口服液——“枳葛口服液”，在一定范圍內(nèi)使用，其療效和口感均得到普遍好評，前期動物實驗表明枳葛口服液能減輕乙醇誘導的肝功能損傷，降低血脂，減少血清中炎癥因子，其發(fā)生作用機制可能與肝臟參與氧化應激的調(diào)控有關(guān)［6］。ALD的發(fā)病機制及其復雜，其中氧化應激在ALD的發(fā)生中起到了核心作用［7］。因此，往往通過檢測肝細胞內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活力能準確地反映肝臟抗氧化應激的水平，檢測氧化應激指標丙二醛（malondialdehyde，MDA）、活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的活性反映肝臟氧化應激所導致的細胞膜損傷程度［8-9］。為了進一步確定在酒精性肝損傷過程中枳葛口服液是否參與氧化應激的調(diào)控，本研究采用乙醇對L-02 肝細胞進行誘導產(chǎn)生氧化應激反應，并同時加用枳葛口服液含藥血清進行干預，觀察枳葛口服液含藥血清對乙醇誘導L-02 肝細胞氧化應激損傷模型中氧化應激指標MDA、ROS 及抗氧化酶SOD 活力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料清潔級雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量175～215 g，由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK（川）2013-065。枳葛口服液由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，規(guī)格20 mL× 6 支/盒，處方組成有枳椇子、葛根、山楂等，有效期2年，批號20171026。人正常肝細胞株（L-02 肝細胞），由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室提供。普通飼料由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供；SOD、MDA 及ROS 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；細胞增殖毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK8）試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購自美國ZEALWAY 公司。本實驗經(jīng)過本院倫理委員會的審批。

1.2 方法

1.2.1 枳葛口服液含藥血清的制備根據(jù)《動物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表》換算出每只大鼠所需藥物劑量并參照吳健等［10］提出的具體給藥劑量公式：給藥劑量=在體試驗的給藥劑量×反應系統(tǒng)中被稀釋的倍數(shù)，最終按大鼠用藥劑量的10 倍灌胃，即枳葛口服液組［8.85 g 生藥/（100 g 體質(zhì)量·d）］，對照組（等體積的生理鹽水），每日早、晚各灌胃1次，連續(xù)5 d。于最后一次給藥1 h 后利用2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）麻醉全部大鼠于腹主動脈取血，將所得血液在室溫下靜置2 h，3 000 r/min 離心10 min，將組內(nèi)血清混合，利用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后置-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 L-02 肝細胞氧化損傷造模將細胞消化后對細胞進行計數(shù)使最終密度為2 × 1110個/mL 并接種于6 孔板中，實驗分為8個組，即對照組和7個不同乙醇濃度組（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、5%），每組設6個復孔，分別干預L-02 肝細胞6、12、24 h，根據(jù)細胞活力及L-02 肝細胞中MDA和ROS 水平以確定乙醇造模的最佳濃度及作用時間。

1.2.3 枳葛口服液含藥血清對乙醇誘導L-02 肝細胞氧化損傷的抗氧化作用將細胞消化后對細胞進行計數(shù)使最終密度為2 × 105個/mL 并接種于6 孔板中，實驗分為6 組，對照組（10%正常大鼠血清培養(yǎng)）、模型組（10%正常大鼠血清+2.5%乙醇培養(yǎng)）和4 組不同濃度的枳葛口服液含藥血清（ZGG 1.25%、ZGG2.5%、ZGG5%、ZGG10%）與2.5%乙醇（YC2.5%）（即ZGG1.25% + YC2.5%組、ZGG2.5% +YC2.5%組、ZGG5%+YC2.5%組、ZGG10%+YC2.5%組）分別處理L-02 肝細胞24 h 后收集細胞。每組設6個復孔。

1.2.4 實驗指標檢測用CCK8 法檢測細胞活力，同時采用硫代巴比妥酸法測定L-02 細胞中MDA的含量，采用熒光酶標儀檢測ROS 水平，硫代巴比妥酸法測定細胞中SOD的活力。

1.3 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計描述計量資料采用表示。計量資料均數(shù)之間的比較采用方差分析，組間兩兩比較采用最小差異顯著法（least significance of difference，LSD法）。統(tǒng)計軟件為SPSS 19.0，以P＜0.05 時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乙醇對L-02 肝細胞氧化損傷造模濃度及時間的篩選不同濃度乙醇干預6、12、24 h 后，細胞存活率隨著乙醇濃度的增加及作用時間的延長呈逐漸下降趨勢，當乙醇濃度為5%時，細胞存活率明顯下降（P＜0.05，表1），而L-02 肝細胞內(nèi)ROS、MDA 隨著乙醇濃度的增加而升高，當乙醇濃度在2.5%～5%時，與對照組相比，干預24 h 后MDA、ROS 含量均明顯升高（P＜0.05，表2、3）。結(jié)合細胞活力最終選取2.5%乙醇濃度作用24 h 復制L-02肝細胞氧化應激損傷模型。

2.2 不同濃度枳葛口服液含藥血清對乙醇誘導L-02 肝細胞氧化損傷的抗氧化作用不同濃度的枳葛口服液含藥血清與2.5%乙醇（即ZGG1.25%+YC2.5%組、ZGG2.5%+YC2.5%組、ZGG5%+YC2.5%組、ZGG10% + YC2.5%組）共孵育細胞24 h 后，與對照組相比：僅枳葛口服液含藥血清最低劑量組（ZGG1.25% + YC2.5%組）的細胞存活率、細胞中MDA、ROS 及SOD 含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組細胞存活率隨著枳葛口服液含藥血清濃度的增加呈逐漸下降趨勢，但存活率均在75%以上（P＜0.05），且各組細胞中MDA、ROS 含量隨著枳葛口服液含藥血清濃度的增加呈逐漸增多趨勢（P＜0.05），各組細胞中SOD 含量隨著枳葛口服液含藥血清濃度的增加呈逐漸減少趨勢（P＜0.05），即枳葛口服液含藥血清濃度越高，以上指標越接近于模型組（表4、5 及圖1）。因此，1.25%枳葛口服液含藥血清濃度對乙醇誘導L-02 肝細胞氧化損傷的抗氧化作用是最佳的。

表1 不同濃度乙醇干預6、12、24 h 后對L-02 肝細胞活力的影響（n=6）Tab.1 Effects of ethanol at different concentrations onthe cell viability of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s

表1 不同濃度乙醇干預6、12、24 h 后對L-02 肝細胞活力的影響（n=6）Tab.1 Effects of ethanol at different concentrations onthe cell viability of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s

注：與對照組相比，*P＜0.05

組別對照組0.5%乙醇組1%乙醇組1.5%乙醇組2%乙醇組2.5%乙醇組3%乙醇組5%乙醇組F 值P 值6 h存活率（%）0.944±0.019 0.935±0.024 0.941±0.008 0.934±0.005 0.938±0.008 0.934±0.004 0.839±0.028*0.774±0.022*119.096＜0.001 OD 值99.78±0.67 97.91±1.87 96.17±1.73*94.02±1.93*96.35±2.54*95.08±1.88*83.14±3.22*77.24±2.65*118.963＜0.001 12 h存活率（%）0.943±0.018 0.928±0.019 0.925±0.018 0.920±0.010*0.861±0.024*0.817±0.020*0.760±0.024*0.708±0.019*180.242＜0.001 OD 值100.00±0.00 94.81±1.74*92.53±1.73*90.83±1.45*83.80±2.20*81.14±1.86*75.62±1.86*70.98±1.89*307.479＜0.001 24 h存活率（%）1.020±0.052 0.990±0.050 0.941±0.008*0.875±0.017*0.837±0.023*0.792±0.022*0.753±0.031*0.633±0.021*148.625＜0.001 OD 值100.00±0.00 97.52±1.06*94.44±1.05*85.56±1.73*79.44±1.13*76.19±1.94*70.72±1.57*64.85±3.87*435.966＜0.001

表2 不同濃度乙醇干預6、12、24 h 后對L-02 肝細胞中MDA 含量的影響（n=6）Tab.2 Effects of ethanol at different concentrations on the MDA content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，nmol/mgprot

表2 不同濃度乙醇干預6、12、24 h 后對L-02 肝細胞中MDA 含量的影響（n=6）Tab.2 Effects of ethanol at different concentrations on the MDA content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，nmol/mgprot

注：與對照組相比，*P＜0.001

組別對照組0.5%乙醇組1%乙醇組1.5%乙醇組2%乙醇組2.5%乙醇組3%乙醇組5%乙醇組F 值P 值6 h 55.89±1.90 57.67±1.58 57.78±2.33 59.89±1.90*61.67±2.45*60.89±2.37*59.78±1.39*61.89±1.83*10.223＜0.001 12 h 60.78±1.92 59.33±2.00 62.22±2.63 61.78±2.17 60.11±2.20 62.56±3.28 60.33±2.50 61.67±2.12 2.013 0.067 24 h 59.22±2.28 61.67±2.34 61.33±2.91 77.44±1.51*85.11±3.48*114.11±6.09*127.00±3.67*158.44±4.61*908.340＜0.001

表3 不同濃度乙醇干預6、12、24 h 后對L-02 肝細胞中ROS 水平的影響（n=6）Tab.3 Effects of ethanol at different concentrations on the ROS content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，U/mg

表3 不同濃度乙醇干預6、12、24 h 后對L-02 肝細胞中ROS 水平的影響（n=6）Tab.3 Effects of ethanol at different concentrations on the ROS content of L-02 hepatocytes after 6 hours，12 hours，and 24 hours of intervention ±s，U/mg

注：與對照組相比，*P＜0.001

組別對照組0.5%乙醇組1%乙醇組1.5%乙醇組2%乙醇組2.5%乙醇組3%乙醇組5%乙醇組F 值P 值6 h 90.33±2.00 91.33±2.12 92.22±2.73 91.00±2.74 90.89±2.03 91.78±2.44 90.44±2.19 91.67±2.45 0.714 0.661 12 h 89.33±1.58 89.78±1.72 91.67±3.28*91.44±1.59 91.89±2.57*92.22±2.44*92.22±2.91*91.67±2.12*1.981 0.071 24 h 90.22±2.44 92.00±2.12 92.78±2.49 94.33±3.24*95.11±3.18**138.00±4.12***183.33±4.24***218.33±6.73***1 527.655＜0.001

表4 不同濃度含藥血清和2.5%乙醇共孵育24 h 后對細胞活力的影響（n=6）Tab.4 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the cell viability of cells after 24hours of incubation ±s

表4 不同濃度含藥血清和2.5%乙醇共孵育24 h 后對細胞活力的影響（n=6）Tab.4 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the cell viability of cells after 24hours of incubation ±s

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05

組別對照組模型組ZGG1.25%+YC2.5%組ZGG2.5%+YC2.5%組ZGG5%+YC2.5%組ZGG10%+YC2.5%組F 值P 值OD 值0.945±0.012b 0.792±0.022a 0.947±0.009b 0.857±0.031ab 0.732±0.024ab 0.666±0.032ab 211.797＜0.001存活率（%）99.78±0.67b 76.19±1.94a 99.33±1.14b 88.94±1.22ab 82.50±2.36ab 77.68±2.23ab 307.23＜0.001

表5 不同濃度含藥血清和2.5%乙醇共孵育24 h 對細胞中MDA、ROS 及SOD 含量的影響（n=6）Tab.5 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the MDA，ROS and SOD content of cells after 24 hours of incubation ±s

表5 不同濃度含藥血清和2.5%乙醇共孵育24 h 對細胞中MDA、ROS 及SOD 含量的影響（n=6）Tab.5 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the MDA，ROS and SOD content of cells after 24 hours of incubation ±s

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05

組別對照組模型組ZGG1.25%+YC2.5%組ZGG2.5%+YC2.5%組ZGG5%+YC2.5%組ZGG10%+YC2.5%組F 值P 值MDA（nmol/mgprot）59.00±2.60b 106.22±4.32a 58.44±3.97b 79.89±4.83ab 90.22±6.14ab 102.00±7.02a 186.097＜0.001 ROS（U/mg）90.33±2.91b 152.00±6.24a 89.11±4.86b 97.89±7.42ab 99.56±7.18ab 140.89±10.08ab 146.175＜0.001 SOD（mg/L）86.00±6.42b 46.51±2.25a 83.11±6.97b 71.22±6.33ab 53.13±5.12ab 48.32±4.25a 216.363＜0.001

圖1 不同濃度含藥血清和2.5%乙醇共孵育24 h 對細胞中MDA、ROS 及SOD 含量的影響Fig.1 Effects of drug serum at different concentrations and 2.5%ethanol on the MDA，ROS and SOD content of cells after 24 hours of incubation

3 討論

正常條件下，肝臟本身含有如SOD、過氧化物酶、谷胱甘肽等抗氧化劑以清除多余的自由基，使細胞氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)保持相對平衡以保護肝細胞免受損傷［11-12］。ALD 中，乙醇誘導的氧化應激產(chǎn)生大量ROS和活性氮自由基團，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導致肝臟損傷［13-14］；同時，當大量乙醇進入體內(nèi)，通過代謝轉(zhuǎn)化為大量乙醛與肝細胞中的蛋白質(zhì)、DNA 發(fā)生整合，形成乙醛加合物，使機體ROS增多，氧化應激水平升高，導致脂質(zhì)過氧化，MDA增高，某些抗氧化物質(zhì)如SOD等大量消耗，削弱機體多個器官特別是肝臟的抗氧化能力，進一步加重肝臟氧化應激損傷［15］。本實驗結(jié)果顯示，2.5%乙醇干預L-02 肝細胞24 h 導致細胞活力減弱，細胞內(nèi)SOD 酶活力明顯降低（P＜0.05），MDA、ROS含量均明顯升高（P＜0.05），說明2.5%乙醇干預L-02 肝細胞24 h 成功誘導氧化應激損傷，導致脂質(zhì)過氧化，抗氧化物質(zhì)SOD 消耗，削弱了肝臟本身的抗氧化能力，這與其他相關(guān)實驗一致［16-17］。

枳葛口服液方劑由枳椇子、山楂、葛根等六味中藥組成，其中枳椇子、葛根為君藥，二者均有解酒毒、生津解郁之功效［18-19］，研究表明葛根素預防性給藥能使急性乙醇中毒大鼠海馬及下丘腦SOD活性增高，MDA 含量降低，葛根素對酒精引起的機體內(nèi)氧化反應有明顯拮抗作用，可對腦組織細胞起到保護的作用［20］。據(jù)現(xiàn)代藥理研究表明：ALD發(fā)病機制中乙醇及其代謝產(chǎn)物——活性氧及毒素MDA等對肝臟產(chǎn)生毒性作用是罪魁禍首，而葛花枳椇子均可降低血液中的乙醇濃度［21-22］，本研究結(jié)果顯示，不同濃度的枳葛口服液含藥血清與2.5%乙醇（即ZGG1.25% + YC2.5%組、ZGG2.5% +YC2.5%組、ZGG5%+YC 2.5%組、ZGG10%+YC2.5%組）共孵育L-02 肝細胞24 h 后，各組與模型組比較，不管是細胞活力還是氧化應激指標MDA、ROS及抗氧化酶SOD等指標均有所改善，且改善程度與枳葛口服液含藥血清濃度呈負相關(guān)，即濃度最小組（ZGG1.25% + YC2.5%組）逆轉(zhuǎn)乙醇誘導L-02肝細胞氧化損傷的效果最佳，濃度最小組的以上指標與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?？梢婅赘鹂诜汉幯蹇墒筁-02 肝細胞內(nèi)抗過氧化酶水平升高，從而提高其抗氧化能力，從而對乙醇誘導的氧化應激損傷有明顯拮抗作用，其中，1.25%枳葛口服液含藥血清濃度對乙醇誘導L-02肝細胞氧化損傷的抗氧化作用最佳。

綜上所述，一定劑量的枳葛口服液對乙醇誘導的氧化應激損傷具有一定的阻止及逆轉(zhuǎn)作用，其機制可能與該復方藥物多靶點、多途徑共同協(xié)同進行降酒毒，增加細胞內(nèi)抗氧化酶SOD的活力，清除或降低已吸收乙醇代謝所產(chǎn)生的毒物——MDA、ROS 含量，從而最終達到有效預防ALD的發(fā)生發(fā)展。