高云兵 岑忠喜 黃建華 鄧貴營 何基琛 曾高峰 宗少暉

1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科（南寧530000）；2廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院（南寧530000）

在人體正常的生理條件下，成年人骨骼中的骨吸收和骨形成處于動態(tài)穩(wěn)定狀態(tài)，從而不斷更新骨組織，不斷保持骨組織的硬度與彈性。破骨細胞是人體中唯一的骨重吸收功能的細胞，對骨的重塑有重大意義。骨組織中破骨細胞的過度分化和活化，是造成骨質疏松癥的重要原因之一［1］。骨質疏松癥是一種年齡相關的疾病，其主要特征是以骨量減少、微結構破壞，骨骼脆性增加、易發(fā)生骨折，是老年人致殘、致死的重要原因之一［2］。流行病學調查顯示：截止到2010年，我國骨質疏松性骨折患者大約有233 萬例，其中髖部的骨折大約有36 萬例，椎體的骨折大約111 萬例，其他骨質疏松性骨折大約86 萬例，為此所支出的醫(yī)療費用高達94.5 億美元［3］。

正因為目前臨床上骨質疏松癥的治療存在治療周期長、費用高昂、全身性副作用較大等許多缺陷，因此尋找有效的治療骨質疏松癥的藥物是非常重要和急切的［4］。在前人的研究中，筆者知道磷酸肌醇依賴的蛋白激酶-1（PDK-1）具有促進骨肉瘤增殖分化的能力，繼而導致骨肉瘤復發(fā)與轉移［5］。目前國內外對PDK-1的研究主要集中在腫瘤、細胞自噬等方面［6-7］，在骨科領域尤其是骨質疏松癥方面尚未有明確系統(tǒng)的報道。在本研究中筆者討論了PDK-1在骨質疏松癥中發(fā)揮的作用，首次創(chuàng)新性地報道了PDK-1 特異性抑制劑（BX-912）可以改善LPS 誘導的小鼠顱骨骨溶解癥狀。本實驗數(shù)據(jù)顯示，BX-912 可以抑制LPS 誘導的小鼠顱骨骨溶解，具有潛在治療骨質疏松癥的作用，為臨床治療骨質疏松癥提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般材料6 周齡雄性C57BL/6 小鼠由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，BX-912 購于Selleck公司，α-MEM 培養(yǎng)基購于Gibco 公司，胎牛血清購于Hyclone 公司，M-CSF和RANKL 購自R&D 公司，戊巴比妥鈉、脂多糖、0.25%胰酶、CCK-8 試劑盒、TRAP 染色試劑盒購自Sigma 公司。

1.2 BMMs的獲取及培養(yǎng)采用頸椎脫位法處死小鼠，75%酒精中浸泡5 min，分離脛骨和股骨。去除骨盆和股骨骨骼周圍殘留的組織，并在膝關節(jié)分離，將骨頭浸入75%酒精中5 min，隨后在PBS 中浸泡5 min，后將其放入DMEM 培養(yǎng)基中。小心剪去骨頭的兩端，用沖洗出骨髓腔內的細胞。收集細胞懸浮液到離心管并以1 000 r/min 離心5 min。去除上清液后，將細胞重懸于含有10%胎牛血清和M-CSF（25 μg/L）的α-MEM 培養(yǎng)基中并種植到T-75培養(yǎng)瓶中，并在溫度為37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，每3 天更換1次含有M-CSF的培養(yǎng)液。在第5 天將BMMs 以6 × 103個細胞/孔的密度轉移到96孔板中，進行下一步實驗。

1.3 細胞增殖-毒性檢測（CCK-8）通過CCK-8測定BMMs 細胞活性。將BMMs 以6 000/孔的密度接種在96 孔板上，在含有濃度為25 μg/L的M-CSF的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，每個濃度接種3個復孔。24 h后，將細胞用不同濃度的BX-912（0、0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）處理0、1、2、3、4和5 d。每孔加入10 μL CCK-8 緩沖液，并將孔板溫育2 h。借助于Microplate Reader795 測量450 nm 波長處的OD值，并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.4 破骨細胞誘導分化及TRAP 染色小鼠骨髓全細胞在含有濃度為25 μg/L的M-CSF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d 后，以8 000/孔的密度種植在96 孔板中，加入含有M-CSF的培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后更換為含有M-CSF（25 μg/L）和RNAKL（100 μg/L）的培養(yǎng)液，同時加入0 μmol/L和0.312 μmol/L 濃度的BX-912，每個濃度接種3個復孔。誘導分化5 d后，吸出培養(yǎng)液用PBS 清洗2次，用4%多聚甲醛固定30 min，吸出多聚甲醛，PBS 清洗2次，每孔加入100 μL TRAP 染液，37 ℃下避光孵育30 min。吸出染液，加入PBS 后再顯微鏡下拍照并計數(shù)破骨細胞數(shù)量。

1.5 LPS 誘導小鼠顱骨骨溶解模型將30 只6 周齡C57BL/6 雄性小鼠隨機分為3 組，每組10 只，分別為：對照組（注射PBS）、LPS 組（5 mg/kg 體質量注射）、BX-912 治療組（LPS 干預和5 mg/kg 體質量注射）。在輕度麻醉下，小鼠在顱骨的矢狀線縫合處皮下注射。在注射LPS 前1 天注射PBS和BX-912（預防性治療），隨后在28 d 內每隔1 天注射。在實驗結束后，處死小鼠，分離顱骨并用4%多聚甲醛固定用于micro-CT和組織學染色分析。組織學染色分析分析，首先將顱骨在4 ℃，10%EDTA（pH 7.4）條件下脫鈣2 周，然后在石蠟中包埋。制作切片用于H&E 染色和TRAP 染色。

1.6 統(tǒng)計學方法所有實驗數(shù)據(jù)均使用表示，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，多樣本均數(shù)進行單因素方差分析，LDS 檢驗進行2 組間比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8 檢測細胞增活性在體內研究BX-912 對小鼠顱骨骨溶解的作用前，筆者首先需要確定BX-912的安全濃度范圍。筆者設置了10個不同的BX-912 濃度（0、0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10和20 μmol/L）測定BX-912 在0、1、2、3、4和5 d 對細胞的毒性作用。在BX-912 濃度為0.625 μmol/L 及更高濃度時，OD值與對照組相比明顯下降（P＜0.05），在濃度為0.312 μmol/L 及更低濃度時，BX-912 對細胞沒有明顯的毒性作用（表1）。

表1 CCK-8 實驗測定BX-912的安全濃度范圍Tab.1 CCK-8 experimental determination of the safe concentration range of BX-912 ±s

表1 CCK-8 實驗測定BX-912的安全濃度范圍Tab.1 CCK-8 experimental determination of the safe concentration range of BX-912 ±s

注：通過CCK-8 測定在BX-912 干預BMMs 在0、24、48、72、96和120 h的OD 值。與對照組相比，BX-912 組（0.625～20）μmol/L 中的OD值顯著降低。BX-912 濃度在0.312 μmol/L 及以下時對BMMs 活性沒有顯著影響（*P＜0.05）

BX-912 濃度干預（μmol/L）0 0.078 0.156 0.312 0.625 1.25 2.5 5 10 20 0 h 1.12±0.032 1.13±0.023 1.11±0.030 1.13±0.021 1.11±0.026 1.13±0.026 1.12±0.034 1.10±0.039 1.11±0.025 1.11±0.033干預24 h 1.36±0.035 1.34±0.033 1.41±0.040 1.35±0.031 1.38±0.029 1.42±0.041 1.34±0.051 0.85±0.030*0.30±0.021*0.27±0.016*干預48 h 1.55±0.050 1.53±0.045 1.61±0.061 1.60±0.053 1.57±0.066 1.51±0.043 1.48±0.040 0.77±0.036*0.31±0.025*0.25±0.020*干預72 h 1.30±0.040 1.28±0.035 1.33±0.041 1.28±0.061 1.35±0.055 1.01±0.044*0.91±0.037*0.70±0.030*0.28±0.022*0.24±0.031*干預96 h 1.35±0.036 1.40±0.041 1.38±0.033 1.33±0.045 1.20±0.037 0.80±0.025*0.75±0.040*0.74±0.031*0.30±0.021*0.27±0.024*干預120 h 1.43±0.280 1.50±0.041 1.46±0.033 1.39±0.037 1.03±0.022*0.77±0.051*0.73±0.038*0.68±0.022*0.27±0.023*0.22±0.036*

2.2 BX-912 對破骨細胞分化的影響小鼠BMMs在含有M-CSF（25 μg/L）和RNAKL（100 μg/L）的培養(yǎng)液中，同時加入0 μmol/L和0.312 μmol/L 濃度的BX-912 干預。誘導分化5 d 后，TRAP 染液確定每組的破骨細胞生成數(shù)。結果顯示：0.312 μmol/L 濃度的BX-912 對破骨細胞生成有明顯的抑制作用（P＜0.001，圖1）。

圖1 BX-912 對破骨細胞生成的抑制作用Fig.1 Inhibition of BX-912 on osteoclastogenesis

2.3 BX-912 保護LPS 誘導的顱骨骨溶解在6 周齡的C57BL/6 小鼠顱蓋的矢狀縫局部皮下注射PBS、LPS、LPS+BX-912。28 d后，與PBS相比，micro-CT 分析顯示LPS 組小鼠顱骨骨溶解嚴重，骨小梁分離度顯著增加，骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)量明顯降低，BX-912 治療組可以明顯提高骨體積分數(shù)、增加骨小梁數(shù)量，降低骨小梁分離度，骨小梁厚度無明顯影響（P＜0.01，P＜0.001）表明BX-912 具有保護LPS誘導的顱骨骨溶解的作用（表2）。組織學H＆E染色結果顯示，BX-912可以顯著增加骨小梁厚度和骨小梁的數(shù)量（圖3）。組織學TRAP 染色結果顯示，BX-912 可顯著抑制LPS 誘導的顱骨骨溶解模型中的破骨細胞生成，減少骨量損失（P＜0.001，圖4）。

表2 BX-912 對小鼠顱骨骨溶解的保護作用Tab.2 Protective effect of BX-912 on osteotomy of mouse calvaria ±s

表2 BX-912 對小鼠顱骨骨溶解的保護作用Tab.2 Protective effect of BX-912 on osteotomy of mouse calvaria ±s

注：LPS 組小鼠顱骨骨溶解嚴重，骨體積分數(shù)和骨小梁數(shù)量明顯降低，骨小梁分離度顯著增加，BX-912 治療組可以明顯提高骨體積分數(shù)、增加骨小梁數(shù)量，降低骨小梁分離度（**P＜0.01，***P＜0.001）

組別PBS 組LPS 組LPS+BX-912骨體積分數(shù)65.3±3.14***35.6±4.60 56.8±2.41**骨小梁數(shù)量8.80±0.55***73.05±0.26 7.68±0.41***骨小梁分離度0.11±0.015***0.19±0.025 0.14±0.033***骨小梁厚度0.109±0.005 0.101±0.004 0.106±0.006

3 討論

骨組織是人體的堅硬組織，具有儲藏礦物質、運動、支持和保護身體等其他重要的功能。骨的重塑是有破骨細胞和成骨細胞共同調控的，當某些病理性因素導致破骨細胞的生成增多或（和）活性增強，就可能導致一些骨溶解疾病，例如骨質疏松癥、骨關節(jié)炎、炎性無菌性松動等，因此抑制破骨細胞的生成和活性已經成為治療骨質疏松重要的靶點。

圖3 組織學H&E 染色Fig.3 Histological H&E staining

圖4 組織學TRAP 染色Fig.4 Histological TRAP staining

破骨細胞是骨組織中唯一可以進行骨重吸收功能的細胞［8］。破骨細胞分化與成熟過程中需要M-CSF 與RANKL 這兩個最重要的兩個細胞因子。RANK/RANKL 信號通路是骨重建的經典信號通路，RANK 是RANKL的唯一的受體，屬于Ⅰ型膜蛋白［9］。成骨細胞表達的RANKL 可以與OCPs的RANK 結合，從而激活下游信號分子。腫瘤壞死因子受體相關因子（TNF receptor-associatedfactor，TRAF）可以與RNAK 進行結合，其中TRAF6 與破骨細胞的生成有關。RANK 與TRAF6 結合可以促使NF-κB 激活，c-Fos 被入核的NF-κB 激活，活化的T 細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT-c1）與激活的c-Fos 進一步與結合并發(fā)揮作用，最終促進破骨細胞生［10］。在本實驗中，破骨細胞受到LPS 刺激后可增強對小鼠顱骨的骨吸收，導致出現(xiàn)骨質疏松癥。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌細胞壁中的一種主要成分，作用于人體內的巨噬細胞等，從而產生白細胞介素1、6和腫瘤壞死因子α等細胞因子，促進破骨細胞分化［11］。調節(jié)破骨細胞前體細胞融合的基因有Connexin43、DCSTAMP、OC-STAMP等，它們調節(jié)破骨細胞前體細胞的遷移，細胞之間的交流，促進破骨細胞前體細胞相互融合［12］。曾立等［13］發(fā)現(xiàn)LPS 在促進破骨細胞生成過程中，能夠顯著促進Connexin43 蛋白表達量的增加，同時能夠促進Connexin43 基因表達，并且呈明顯的濃度依賴性。Connexin43 是細胞之間營養(yǎng)素、代謝產物、小分子等彼此交換的重要通道［14］，在破骨細胞的形成、發(fā)揮骨吸收功能、以及骨重建過程中發(fā)揮了重要的作用。LPS 通過促進Connexin43 表達，提升了破骨細胞前體細胞間小分子物質的交換，促進了破骨細胞的生成，使誘導生成的破骨細胞更多、體積更大，進而提升了破骨細胞的骨吸收功能。LPS 同時也是一種導致炎癥性骨丟失的病原體［15］。臨床上，細菌感染導致的骨不連、感染性關節(jié)炎的患者往往伴有骨吸收異常增強導致的骨丟失。

在本研究中，筆者明確了PDK1 特異性抑制劑（BX-912）在0.312 μmol/L 及以下濃度時對BMMs的活性沒有明顯抑制，同時在本實驗中構建了LPS誘導小鼠顱骨骨溶解模型并與BX-912 治療組進行對比，通過micro-CT 掃描、H&E 染色、TRAP 染色分析。在BX-912 治療組，micro-CT 掃描重建及軟件分析顯示骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)目明顯提高、骨小梁分離度降低，證明BX-912 在LPS 誘導顱骨骨溶解模型中具有抑制骨溶解的作用。組織切片H&E 染色發(fā)現(xiàn)BX-912 治療后以改善LPS 引起的顱骨缺損癥狀，并顯著增加骨小梁厚度和骨小梁的數(shù)量，組織切片TRAP 染色發(fā)現(xiàn)BX-912 可顯著抑制LPS 誘導的顱骨骨溶解模型中的破骨細胞生成。筆者的數(shù)據(jù)表明BX-912 具有潛在預防和治療與破骨細胞有關的骨質疏松癥的作用，提示臨床上治療因感染導致的骨丟失時，抑制LPS 吸收是重要的關鍵措施。在筆者之前尚未有PDK-1 在骨質疏松癥中的作用的相關報道，筆者相信這項研究是有意義并且有前景的。同時筆者的工作存在一些不足之處，沒有對具體的生物學機制和成骨細胞的作用的進行深入的研究，接下來筆者將完善BX-912 抑制破骨細胞生成的具體生物學機制，同時將對成骨細胞的作用進行研究。