何瑋 鄭慶麗 陳健 曹獻(xiàn)英

摘? 要? 為了除去油茶粕蛋白的色素，添加體積分?jǐn)?shù)為4%的雙氧水在40 ℃下作用蛋白提取液1 h可取得較好的脫色效果，但雙氧水脫色對油茶粕蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響需要進(jìn)一步研究。本文通過測定變性溫度、表面疏水性和巰基的含量，分析紅外光譜、X射線衍射峰、微觀形貌等研究脫色前后油茶粕蛋白結(jié)構(gòu)和功能的變化。結(jié)果顯示：雙氧水脫色使油茶粕蛋白的表面疏水性上升，巰基含量下降，二硫鍵含量基本不變;通過紅外光譜分析，雙氧水脫色減弱了油茶粕蛋白化學(xué)鍵強(qiáng)度，但沒有影響油茶粕蛋白基本骨架，微觀結(jié)構(gòu)基本相似，油茶粕蛋白的X射線衍射峰的位置和強(qiáng)度基本一致，熱變性溫度升高，雙氧水沒有改變油茶粕蛋白的等電點(diǎn)，但油茶粕蛋白的溶解度、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均下降，持油性和持水性上升。本研究結(jié)果表明雙氧水脫色未明顯改變油茶粕蛋白的結(jié)構(gòu)，但其功能性質(zhì)受到一定影響。

關(guān)鍵詞? 雙氧水脫色;油茶粕蛋白質(zhì);結(jié)構(gòu);功能特性中圖分類號? TS201.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

Abstract? In order to remove the pigment of seed cake protein from Camellia Oleifera， the protein extract was treated with 4% （V/V） hydrogen peroxide at 40 ℃ for 1 h， and a better decolorization effect was obtained. However， the effect of decolorization with hydrogen peroxide on the function and structure of the protein was worthy of discussion. The changes of protein structure and function before and after decolorization were studied by measuring denaturation temperature， surface hydrophobicity and sulfhydryl content， analyzing infrared spectrum， X-ray diffraction peak and microstructure， etc. Decolorization with hydrogen peroxide caused the surface hydrophobicity increased， the sulfhydryl content decreased， and the disulfide bond content remained basically unchanged， and the chemical bond strength weakened. But the basic skeleton， the microstructure， the position and intensity of the X-ray diffraction peak of C. sinensis were basically the same. The heat denaturation temperature increased， the isoelectric point did not change， but the solubility， emulsifying properties， emulsion stability， foaming ability and foam stability of protein decreased， and oil and water holding capacity increased. The results showed that the decolorization of hydrogen peroxide did not significantly affect the protein structure， but its functional properties were affected.

Keywords? hydrogen peroxide decolorization; protein from Camellia Oleifera seed cake; structure; functional properties

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.022

油茶是我國南方一種特有的油料植物。油茶粕作為油茶榨完油后的主要副產(chǎn)物，其蛋白含量9%～13%[1-2]，油茶粕蛋白含有17種氨基酸成分，其中8種是人體必需的氨基酸，是優(yōu)質(zhì)的蛋白資源，極具開發(fā)潛力[3]。但油茶經(jīng)高溫?zé)嵴ズ?，從剩下的餅粕中提取的蛋白呈深褐色，?yán)重制約了油茶粕蛋白的應(yīng)用。年賀鳳等[4]用雙氧水對葡萄籽蛋白脫色，蛋白損失率達(dá)21.79%，白度為14.71，表明雙氧水對葡萄籽蛋白脫色效果好。楊旭等[5]用雙氧水對茶渣蛋白脫色也取得了較好的效果，脫色率達(dá)到93.78%，蛋白損失率為44.60%。Xie等[6]采用超聲波輔助雙氧水對青椒多糖進(jìn)行脫色，通過高效液相色譜、紅外光譜、核磁共振分析表明脫色沒有對多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。在本課題組的前期研究中，采用活性炭和大孔吸附樹脂等物理吸附方法對油茶粕蛋白質(zhì)提取液脫色效果不好，利用雙氧水的氧化劑特性使有色物質(zhì)氧化分解成低分子醛、羧酸、二氧化碳類物質(zhì)，脫色效果明顯且脫色后不易復(fù)色[7]。本文以油茶粕為原料，堿溶酸沉提取蛋白，在40 ℃條件下，添加體積分?jǐn)?shù)為4%的雙氧水對蛋白提取液脫色1 h得到脫色蛋白，對比分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的差異，研究雙氧水脫色對油茶粕蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，對脫色油茶粕蛋白進(jìn)行質(zhì)量評價，以期為油茶粕蛋白加工及新產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 油茶粕（熱壓法）：海南省瓊海市中原合作社。

三氯乙酸（TCA）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、甘氨酸，來自北京索萊寶科技有限公司;5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB），阿拉丁生化科技有限公司;牛血清白蛋白V標(biāo)品（BSA），德國BioFROXX有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2? 儀器與設(shè)備? AUW-220型電子分析天平，日本島津公司;DS-1型高速組織破碎機(jī)，北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司;CR22N型落地式高速冷凍離心機(jī)，北京安麥格貿(mào)易有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SCIENTZ-10N型真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;Delta320-S型精密pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司;85-1型磁力加熱攪拌器，常州澳華儀器有限公司;Master-EUVF型超純水機(jī)，上海和泰儀器有限公司;752N型紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司;Ultra-Turrax型分散機(jī)，德國IKA公司;Q100型差式掃描量熱儀（DSC），美國TA儀器公司;AXIS SUPRA型X射線光電子能譜儀（XRD），日本島津-Kratos公司;Lambda750s型紅外光譜儀（IR），美國PE公司;S-3000型掃描式電子顯微鏡（SEM），日本Hitachi公司。

1.2? 方法

1.2.1? 油茶粕脫色蛋白的制備? 油茶粕破碎后過60目篩，在室溫下，油茶粕粉在石油醚中以1∶8的料液比脫脂2 h，此過程重復(fù)2次，得到脫脂油茶粕粉。脫脂油茶粕粉在90%的乙醇中以1∶10的料液比磁力攪拌2 h后，40 ℃烘干備用。堿溶酸沉提取油茶粕蛋白，將處理過的油茶粕粉溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液pH為10，置于50 ℃下磁力攪拌2 h獲得蛋白提取液，添加體積分?jǐn)?shù)為4%的雙氧水，在40 ℃條件下磁力攪拌1 h，調(diào)節(jié)油茶粕蛋白溶液pH至等電點(diǎn)3.5，靜置30 min后，于6500 r/min離心30 min得到沉淀，經(jīng)80%乙醇洗滌3次，用超純水復(fù)溶沉淀，裝入截留量為8 ku的透析袋中透析，每隔6 h換一次水，透析48 h后冷凍干燥得到蛋白粉末，置于-20 ℃保存。

1.2.2? 油茶粕蛋白表面疏水性的測定? 參考袁星星等[8]的方法，略作改動。分別取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mmol/L的SDS溶液1 mL，依次加入20 mL氯仿和5 mL 0.24 g/L亞甲基藍(lán)溶液，混勻后3000 r/min 離心15 min，取底層SDS與亞甲基藍(lán)的混合物，在655 nm波長下測定吸光度。蛋白質(zhì)的表面疏水性用1 mg蛋白質(zhì)結(jié)合SDS含量（mg/mg）表示。吸光度（y）與SDS濃度（x）的回歸方程為y=4.2386x-0.0168（R2=0.9926）。

稱取10 mg樣品溶于40 mL 0.1 mmol/L SDS溶液，室溫?cái)嚢? h，5000 r/min 離心10 min，上清液透析36 h后，取1 mL透析液與20 mL氯仿混勻，然后在氯仿層中加入5 mL 0.24 g/L亞甲基藍(lán)溶液，充分混勻后3000 r/min離心15 min，取底層SDS與亞甲基藍(lán)的混合物，在655 nm波長下測定吸光度。蛋白質(zhì)表面疏水性的計(jì)算公式如下：

1.2.3? 油茶粕蛋白總巰基和游離巰基含量的測定? 采用DTNB比色法測定油茶粕蛋白的游離巰基和總巰基的含量[9-10]。稱取0.05 g蛋白樣品溶解在4 mL 8 mol/L尿素Tris-Gly溶液（pH 8.0），室溫磁力攪拌1 h后9000 r/min離心15 min，取上清液作為蛋白液樣品，采用雙縮脲法測定上清液的蛋白質(zhì)含量。

（1）游離巰基含量的測定。量取1 mL蛋白液樣品，加入5 mL含 8 mol/L尿素的Tris-Gly溶液（pH 8.0）和0.04 mL 4 mg/mL DTNB，在25 ℃下水浴25 min后，于412 nm處測定吸光度B，空白對照中以Tris-Gly 8 mol/L尿素溶液代替蛋白樣品液。游離的巰基按照如下公式計(jì)算：

式中，D：稀釋因子，對游離巰基測定中的D值取6.04;ρ：蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度（mg/mL）;73.53：106/（1.36×104），其中1.36×104為Ellman試劑的摩爾消光系數(shù)[L/（mol·cm）]。

（2）總巰基含量測定。量取0.6 mL的蛋白液樣品，加入3.0 mL 8 mol/L Tris-Gly尿素溶液（含pH為8.0的40 mmol/L DTT），在25 ℃下水浴1 h，再加入6 mL 12% TCA，繼續(xù)在25 ℃下水浴1 h，5000 r/min離心10 min，沉淀物用12% TCA溶液洗滌4次后溶于9.0 mL 8 mol/L Tris-Gly尿素溶液，然后加入0.09 mL 4 mg/mL DTNB溶液，在25 ℃下水浴25 min，于412 nm處測定吸光度B1?？値€基含量計(jì)算公式如下：

式中，D：稀釋因子，對總巰基測定中的D值取16.15;ρ：蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.2.4? 油茶粕蛋白熱變性溫度的測定? 稱取2 mg油茶粕蛋白樣品，鋪在鋁盒中壓片，置于差式掃描量熱儀測試，掃描溫度范圍為20～180 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮?dú)饬魉?0 mL/min[11]。

1.2.5? 油茶粕蛋白紅外光譜分析? 取1 mg油茶粕蛋白樣品與100 mg KBr混勻，研缽中研磨10 min，壓制成片，置于紅外光譜儀中在波長500～ 4000 cm-1區(qū)間進(jìn)行掃描[12]。

1.2.6? 油茶粕微觀形貌的觀察? 采用掃描電鏡對油茶粕蛋白粉末微觀形貌進(jìn)行觀察。操作步驟如下：將凍干后的固體粉末樣品均勻平攤在貼有導(dǎo)電膠的樣品臺上，噴金處理，觀察成像時加速電壓20 kV[13]。

1.2.7? 油茶粕蛋白X射線衍射分析? 油茶粕蛋白壓制成片，置于用X射線衍射儀中進(jìn)行測試，掃描范圍在2°～55°，速率為3°/min。

1.2.8? 油茶粕蛋白溶解度的測定? 稱取100 mg油茶粕蛋白分散在10 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液pH分別至2～12，室溫振蕩30 min，4000 r/min離心20 min，取上清，蛋白含量用雙縮脲法測定，每組分別加入10.0 mg/mL BSA 溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，然后分別加入0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.0 mL超純水，最后加入3 mL雙縮脲試劑[14-15]。混勻后，37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，分別通過紫外分光光度法測定540 nm波長下吸光度值，求3組平均值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0365x-0.0011（R2=0.9997），其中y代表在540 nm下測得的吸光度，x表示蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），溶解度按照下列公式計(jì)算：

1.2.9? 油茶粕蛋白乳化性及其乳化穩(wěn)定性? 稱取60 mg油茶粕蛋白分散在 6 mL 0.01 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，室溫下震蕩30 min后加入2 mL大豆色拉油，然后在轉(zhuǎn)速20 000 r/min下均質(zhì)1 min，用移液槍從底部吸取乳狀液50 μL，立即與5 mL 0.1% SDS 漩渦混合5 s（以SDS溶液為空白對照），于500 nm處測定吸光度A0。10 min后再次用移液槍從底部吸取50 μL乳狀液加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，混勻后于500 nm處測定吸光度A1，乳化性及乳化穩(wěn)定性按照下列公式計(jì)算[14-15]：

式中，C：稀釋前多肽濃度（g/mL）;φ：光程（1 cm）;θ：形成乳液的油的體積分?jǐn)?shù)（0.25）;DF：稀釋倍數(shù) （100）。

式中，A0：0 min時于500 nm處的吸光值;A1：10 min時于500 nm處的吸光值。

1.2.10? 油茶粕蛋白起泡性的測定? 稱取50 mg樣品分散在0.01 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，記錄初始體積V0，然后使用分散機(jī)在轉(zhuǎn)速 10 000 r/min 下分散2 min，并記錄此時的體積V1，放置30 min后，記錄此時體積V2，起泡性及起泡穩(wěn)定性按照下式計(jì)算[14-15]：

1.2.11? 油茶粕蛋白持水性及持油性的測定? 稱量100 mg蛋白樣品于10 mL 離心管中，然后加入2 mL去離子水（或大豆油），漩渦震蕩30 s，使得樣品與水（或油）充分混勻。室溫震蕩30 min，4000 r/min離心10 min，除去離心管上層的水（或油），稱量離心管和沉淀的質(zhì)量。蛋白樣品的吸水性（或吸油性）可計(jì)算為[14-15]：

式中，W0：蛋白樣品的質(zhì)量（g）;W1：離心管與樣品的總質(zhì)量（g）;W2：離心管與沉淀的總質(zhì)量（g）。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

采用DPS9.5軟件配對兩處理t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 8.5軟件完成繪圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 結(jié)構(gòu)性質(zhì)的測定

如表1所示，雙氧水脫色蛋白的表面疏水性顯著高于未脫色蛋白（P<0.05），雙氧水脫色蛋白的游離巰基和總硫基含量顯著低于未脫色蛋白（P<0.05），二硫鍵的含量為總巰基含量減去游離巰基含量的1/2，由表1可知脫色前后油茶粕蛋白的二硫鍵含量變化不大。

2.2? DSC分析

如圖1所示，雙氧水脫色蛋白和未脫色蛋白的DSC曲線都呈V型，前者的熱變性溫度為103.25 ℃，后者的熱變性溫度為100.77 ℃，可能雙氧水脫色使得非極性氨基酸側(cè)鏈增強(qiáng)了氨基酸殘基表面空間復(fù)雜度大而有序的水合網(wǎng)絡(luò)，形成聚集體;雙氧水脫色使油茶粕蛋白熱容增大，大量氨基酸發(fā)生縮聚（放熱）和重聚合（放熱）反應(yīng)時的溫度升高，所以脫色蛋白熱變性溫度升高。

2.3? 紅外光譜分析

對雙氧水處理前后的蛋白進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果如圖2所示，雙氧水脫色蛋白與未脫色蛋白都在3600～3200 cm-1出現(xiàn)寬峰，雙氧水脫色蛋白在3425 cm-1處強(qiáng)吸收，未脫色蛋白在3358 cm-1處強(qiáng)吸收，表示O-H的伸縮振動，分子間或分子內(nèi)存在氫鍵;雙氧水脫色蛋白和未脫色蛋白在2932 cm-1處都有吸收峰，表示烷烴—CH2或—CH3的C-H伸縮振動;雙氧水脫色蛋白在1653 cm-1處和1543 cm-1處吸收，未脫色蛋白在1657 cm-1和1541 cm-1處吸收，表示 CONH 基團(tuán) C=O鍵伸縮振動，是肽鍵的特征吸收峰，且N-H對于C=O是反式構(gòu)型。

2.4? 掃描電鏡分析

如圖3所示，雙氧水脫色蛋白與未脫色蛋白從微觀形貌上基本相似，在低倍電鏡下主要呈片

狀結(jié)構(gòu)，這是堿性水溶液提取造成的[15]，在高倍下呈球狀，坍塌的球體可能是蛋白質(zhì)和水組成的顆粒在冷凍干燥過程中不均勻收縮造成的[16]，高倍鏡下的雙氧水脫色蛋白內(nèi)部出現(xiàn)部分空隙，總體微觀結(jié)構(gòu)變化較小。

2.5? X射線衍射分析

如圖4所示，2個樣品都出現(xiàn)了3個特征性X射線衍射峰，雙氧水脫色的油茶粕蛋白粉末衍射峰分別在5.50°、9.35°、19.13°附近出現(xiàn)，未脫色的油茶粕蛋白粉末衍射峰分別在4.88°、8.62°、19.95°附近出現(xiàn)，油茶粕蛋白X衍射峰的位置與Wang等[17]人研究大豆分離蛋白衍射峰的位置相似。

2.6? 溶解度的測定

如圖5所示，隨pH的增加，pH-溶解度曲線呈先下降后上升的趨勢，即呈V型。由圖5可知油茶粕蛋白的等電點(diǎn)在pH 3.5左右，雙氧水脫色使油茶粕蛋白溶解度下降，但沒有改變油茶粕蛋白的等電點(diǎn)。

2.7? 功能性質(zhì)測定

由表2可知，雙氧水脫色蛋白的乳化性、乳化穩(wěn)定性、泡沫穩(wěn)定性、起泡能力都顯著低于未脫色蛋白（P<0.05），雙氧水脫色蛋白的持水性和持油性顯著優(yōu)于未脫色蛋白（P<0.05），這與周麟依等[18]研究丙二醛氧化對米糠蛋白功能性質(zhì)影響的結(jié)果相似。

本研究采用體積分?jǐn)?shù)為4%的雙氧水在40 ℃條件下對油茶粕蛋白提取液作用1 h，研究雙氧水脫色對油茶粕蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：雙氧水脫色使油茶粕蛋白的表面疏水性上升，可能雙氧水使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)略微展開，分子內(nèi)部的一些疏水性的芳香族和脂肪族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)暴露到極性溶液中，促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊，導(dǎo)致表面疏水性增加[19-20]，這與Morzel等[21]的研究結(jié)果一致。游離巰基和總巰基含量下降，說明雙氧水的脫色使蛋白質(zhì)巰基發(fā)生了氧化，蛋白質(zhì)巰基的氧化狀態(tài)分為可逆和不可逆氧化狀態(tài)，可逆地生成二硫鍵和次磺酸，不可逆地生成亞磺酸和磺酸，二硫鍵含量變化不大，說明蛋白巰基氧化狀態(tài)基本是可逆狀態(tài)，是可恢復(fù)的[22]。

通過IR分析，雙氧水脫色減弱了油茶粕蛋白的氫鍵、C-H伸縮振動強(qiáng)度、C=O鍵伸縮振動，脫色前后油茶粕蛋白官能團(tuán)和化學(xué)鍵種類基本一致，脫色沒有破壞蛋白質(zhì)基本骨架，通過DSC分析顯示油茶粕蛋白的熱變性溫度升高，這與邱天福等[23]采用DSC手段研究烷過氧自由基氧化修飾對大豆蛋白變性溫度影響的結(jié)果相似。SEM結(jié)果顯示雙氧水脫色使油茶粕蛋白內(nèi)部出現(xiàn)少量空隙，微觀形貌改變較小，XRD分析表明雙氧水脫色基本沒有改變油茶粕蛋白的X射線衍射峰的位置和強(qiáng)度。

本研究結(jié)果表明雙氧水沒有改變油茶粕蛋白的等電點(diǎn)，但油茶粕蛋白的溶解度、乳化性、乳化穩(wěn)定性下降，可能是蛋白發(fā)生共價交聯(lián)聚集，形成不溶性集體造成的。起泡能力和泡沫穩(wěn)定性降低，原因可能是雙氧水使油茶粕蛋白不能在氣-液界面充分展開，無法形成具有良好粘彈性且能阻隔空氣滲透的連續(xù)蛋白膜造成的[24]。持油性和持水性上升，可能是油茶粕蛋白氧化程度較低，蛋白空間結(jié)構(gòu)略微張開，蛋白分子柔性增加，較多的水分子有機(jī)會進(jìn)入蛋白內(nèi)部，從而增加持水性，蛋白暴露出來的部分疏水集團(tuán)可與脂質(zhì)結(jié)合，增加其持油性[25]。

在本研究特定的脫色條件下，通過對表面疏水性、巰基含量、官能團(tuán)、熱變性溫度、X射線衍射峰、微觀形貌的測定，表明雙氧水脫色對油茶粕蛋白結(jié)構(gòu)影響較小，通過測定油茶粕蛋白溶解度、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡能力、泡沫穩(wěn)定性、等電點(diǎn)、持油性和持水性，表明雙氧水脫色對油茶粕蛋白的功能性質(zhì)有一定的影響，但其理化性質(zhì)等電點(diǎn)沒有改變。綜合考慮，可以采用體積分?jǐn)?shù)為4%的雙氧水在40 ℃條件下對油茶粕蛋白提取液作用1 h除去油茶粕蛋白的深褐色。

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