王媛媛 韓洋洋 耿慶鎏 朱香豫 曹樹青 樊婷婷

摘要[目的]以野生型擬南芥為材料構(gòu)建MDH2基因GFP載體及GFP轉(zhuǎn)基因植株，研究MDH2基因在植物響應(yīng)鎘脅迫機(jī)制中的功能。[方法]通過提取野生型擬南芥的RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，并以cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增MDH2基因，將擴(kuò)增所獲得MDH2基因和pXB94-GFP質(zhì)粒雙酶切后連接，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，鑒定正確后再轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌落PCR鑒定出陽性單菌落。再通過浸花法轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，最后利用抗性篩選和PCR鑒定獲得MDH2轉(zhuǎn)基因陽性植株。[結(jié)果] 成功克隆MDH2基因，并構(gòu)建了MDH2GFP重組質(zhì)粒，抗性篩選獲得了MDH2GFP轉(zhuǎn)基因植株。[結(jié)論]成功獲得MDH2GFP轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步研究該基因在植物響應(yīng)鎘脅迫機(jī)制中的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞擬南芥;MDH2;載體;轉(zhuǎn)基因植株

中圖分類號Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.028

土壤重金屬污染已成為世界性的環(huán)境問題之一，其中重金屬鎘污染是對動植物具有高毒害性的污染物之一，過量的鎘會對動植物細(xì)胞造成不可逆的損傷[1-4]。植物對重金屬脅迫的響應(yīng)機(jī)制主要有控制金屬流入、促進(jìn)金屬泵出、重金屬螯合等途徑[5-7]。利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)對植物品種進(jìn)行優(yōu)化改良是解決上述問題的一種行之有效的方法 [8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，MDH2功能缺失突變體對重金屬鎘脅迫表現(xiàn)出耐受的表型，因此筆者擬通過克隆MDH2基因，構(gòu)建MDH2過表達(dá)植株，以進(jìn)一步探究MDH2基因在擬南芥響應(yīng)鎘脅迫機(jī)制中的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料。該試驗(yàn)所用植物材料為擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞（Columbia，col）遺傳背景，購于美國擬南芥種質(zhì)資源中心，后由該實(shí)驗(yàn)室（合肥工業(yè)大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室）繁殖所得。載體構(gòu)建所用質(zhì)粒pXB94-GFP、大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑。Plasmid miniprep Kit、Easy Taq DNA Polymerase、DNA loading buffer均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;T4-DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶Xho I、Eco RI購自NEB公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase購自TaKaRa公司;Agar、 NaCl、異丙醇、氯仿、無水乙醇、葡萄糖、蔗糖購自國藥集團(tuán);壯觀霉素、慶大霉素、卡那霉素生工生物工程（上海）股份有限公司;Goldview、Silwet L-77購自索萊寶公司。

1.2方法

1.2.1擬南芥無菌苗培養(yǎng)。配制1/2 MS固體培養(yǎng)基，從冰箱取出1/2MS培養(yǎng)基放置至室溫，稱取所需要的組分放入三角瓶中，加入一定量的蒸餾水，用5 M/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8，用封口膜封好后高壓蒸汽滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右，將培養(yǎng)基均勻倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，吹干表面水分即可播種。將消毒清洗后的擬南芥種子于濾紙上晾干，種子晾干后按試驗(yàn)需要用牙簽蘸取均勻點(diǎn)在培養(yǎng)皿上，待培養(yǎng)皿播種完成后，用封口膜將培養(yǎng)皿封好;將播種完成后的培養(yǎng)皿倒置于4 ℃冰箱中春化3 d，取出后放置于專用培養(yǎng)室中恒溫（21 ℃左右）光照豎直培養(yǎng)14 d。定期觀察擬南芥生長情況。

1.2.2擬南芥總RNA的提取。提前一天將所需研缽清洗干凈，放入烘箱烘干后用錫紙包裹起來，置于180 ℃的高溫烘箱中，烘烤至少4 h;在試驗(yàn)開始前，要提前將所用試劑如氯仿、無水乙醇、異丙醇等高溫烘烤后的研缽放入-20 ℃冰箱中預(yù)冷。

用鑷子輕輕從培養(yǎng)皿中挑取擬南芥幼苗100 mg左右，用濾紙吸干水分，置于預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮進(jìn)行充分研磨。向充分研磨后的材料中加入Trizol裂解液1 mL，立即快遞研磨至全部融化;轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，于室溫中靜置5 min，讓樣品充分裂解。在超凈臺中向每個樣品中加入200 μL氯仿，上下劇烈搖晃15 s混勻樣品，再于室溫下靜置5 min后使用冷凍離心機(jī)4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速為13 000 r/min。此時可見液體分層，小心吸取500 μL上清液至另一新的1.5 mL EP管中;再向該EP管中加入500 μL預(yù)冷后的異丙醇，輕輕顛倒混勻6～8次，于室溫下靜置10 min;使用冷凍離心機(jī)4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，小心棄除上清，留取沉淀，沉淀即為RNA。緩慢加入事先用DEPC水配制的75%乙醇1 mL清洗沉淀;冷凍離心機(jī)8 000 r/min，4 ℃離心5 min，再次棄去上清，于超凈臺室溫干燥10 min，使乙醇揮發(fā)干凈;向離心管中加入40 μL的DEPC水溶解，并放入65 ℃的水浴中10 min，使RNA沉淀充分溶解，溶解后吸出少量立即檢測其濃度與純度。

1.2.3擬南芥cDNA的反轉(zhuǎn)錄。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將濃度及純度符合標(biāo)準(zhǔn)的野生型擬南芥總RNA溶液反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用作基因克隆的模板。

1.2.4MDH2基因的克隆。利用Oligo 7.0軟件設(shè)計以下引物進(jìn)行MDH2基因的克隆。上游引物為FP：5′-CCGCTCGAGATGTTCCGATCAATGAT-3′，下游引物為RP：5′-CCGGAATTCTTGGTTGGCAAATTTGA-3′，以cDNA為模板進(jìn)行基因克隆。

1.2.5大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。從-80 ℃冰箱中取出大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰上解凍。解凍后，取5 μL質(zhì)粒獲連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕柔吹打混勻后，冰浴30 min。之后42 ℃熱擊60 s，迅速置于冰上2 min。隨后加入到750 mL無菌未加抗性的LB液體培養(yǎng)基中，放在37 ℃搖床中低速震蕩培養(yǎng)1 h。6 000 r/min離心10 min，留200 μL涂布于LB+壯觀霉素的平板上。平板倒置放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

在過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)皿上挑取單克隆菌株接種于LB+壯觀霉素的液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁即可進(jìn)行菌液PCR鑒定。

1.2.6農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。從-80 ℃冰箱中取出農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰上解凍。解凍后，取5 μL質(zhì)粒加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕柔吹打混勻后，加入到預(yù)冷的0.1㎝電擊杯中，調(diào)節(jié)電脈沖、電壓和電阻數(shù)值，迅速將電擊后感受態(tài)細(xì)胞加入到750 mL無菌未加抗性的LB液體培養(yǎng)基中，放在28 ℃搖床中低速震蕩培養(yǎng)1 h。6 000 r/min離心10 min，棄去多余培養(yǎng)基，留200 μL涂布于LB+壯觀霉素的平板上。平板倒置放在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。

在培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿上挑取單克隆菌株接種于LB+壯觀霉素的液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁即可進(jìn)行菌液PCR鑒定是否為所需陽性菌株。

1.2.7花序浸染法獲取轉(zhuǎn)基因擬南芥。將已確定的含有表達(dá)載體的陽性農(nóng)桿菌接種于含壯觀霉素的LB培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)至OD600=1.2～1.6，低速離心后收集菌株，重懸于配制好的浸染緩沖液中，調(diào)整溶液OD600=0.8～1.0，最后加入一定量的SilwettL-77混勻，進(jìn)行花序浸染。浸染完成后黑暗處理24 h。隔7 d，再次進(jìn)行浸染。

1.2.8轉(zhuǎn)基因陽性植株鑒定。將獲得的擬南芥種子置于含有卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選，長出具有根且子葉顏色嫩綠的幼苗，即為轉(zhuǎn)基因陽性植株。

2結(jié)果與分析

2.1擬南芥MDH2基因的克隆為驗(yàn)證MDH2基因在擬南芥鎘耐受機(jī)理中的作用，構(gòu)建MDH2過表達(dá)載體。以植物總RNA反轉(zhuǎn)所得的cDNA為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增MDH2基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，PCR所得片段大小為1 026 bp，與擬南芥網(wǎng)站顯示MDH2基因CDS全長結(jié)果一致。

2.2過表達(dá)載體的連接和轉(zhuǎn)化基因擴(kuò)增引物設(shè)計時，在上下游引物分別添加了限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRI的酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基，PCR擴(kuò)增所得片段可使用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRI對通過基因克隆獲得的MDH2基因和pXB94-GFP質(zhì)粒同時進(jìn)行雙酶切。酶切以后進(jìn)行電泳檢測，酶切后的基因片段和載體質(zhì)粒條帶清晰，大小正確。

將酶切后的基因片段與質(zhì)粒片段用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物采取熱擊法導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)過夜后挑取單克隆菌落于加有相應(yīng)抗性的液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至菌液渾濁。

對上一步所得渾濁單克隆菌液進(jìn)行菌落PCR鑒定，所用引物為MDH2片段擴(kuò)增引物，結(jié)果如圖2所示。除了2號與5號菌落，其他菌落PCR條帶與MDH2基因大小一致，說明該條帶為陽性克隆。選取1號菌液進(jìn)行測序，結(jié)果與MDH2 CDS序列完全吻合，說明成功構(gòu)建MDH2-GFP載體。

2.3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及花序浸染將測序正確的MDH2-GFP重組質(zhì)粒通過電擊法轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101，接種于含慶大霉素和壯觀霉素的培養(yǎng)基上，待其長出單菌落后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示，所選單克隆菌株除1號菌株外均為陽性單克隆。將轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌進(jìn)行振蕩培養(yǎng)后，對正處于開花期的野生型擬南芥使用花序浸染法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。

2.4 MDH2-GFP轉(zhuǎn)基因植株的抗性篩選獲取浸染后的擬南芥種子，將獲得的種子干燥春化后播種在含有卡那霉素抗性的MS平板上，放置4 ℃ 3 d后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，長出來的小苗（具有根，子葉顏色嫩綠）就是轉(zhuǎn)基因陽性植株，如圖4所示。

2.5MDH2-GFP轉(zhuǎn)基因陽性植株的驗(yàn)證將MDH2-GFP轉(zhuǎn)基因陽性植株移栽至土壤中，置于專用培養(yǎng)室中恒溫光照培養(yǎng)，20 d后提取轉(zhuǎn)基因植株DNA，進(jìn)行鑒定。PCR鑒定結(jié)果如圖5所示，篩選所得植株均為轉(zhuǎn)基因陽性植株，即MDH2-GFP轉(zhuǎn)基因植株。

3討論

重金屬污染對環(huán)境及生物的危害嚴(yán)重，尤其是重金屬可以通過食物鏈富集和污染水資源，對人體健康和環(huán)境安全造成極大的威脅[9]。近年來，植物修復(fù)的出現(xiàn)和迅速發(fā)展為土壤重金屬污染提供了一條新的治理途徑。相對于常規(guī)的污染土壤治理方法，植物修復(fù)以其廉價、清潔、易操作的優(yōu)點(diǎn)而成為最有潛力的技術(shù)之一[10]。

筆者自擬南芥種子資源中心獲得MDH2基因功能缺失型突變體，在前期研究結(jié)果顯示MDH2基因參與了植物對鎘脅迫的響應(yīng)，因此通過基因工程技術(shù)構(gòu)建MDH2-GFP重組載體，并通過生物學(xué)手段將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。這對研究MDH2基因在植物鎘耐受調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)，是一項非常有意義的研究性課題。

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