劉婷婷 滕金浩

摘要[目的] 探索受銅污染土壤的微生物修復(fù)方法。[方法]運(yùn)用單因素分析方法對受銅濃度脅迫的微生物進(jìn)行篩選分離以及馴化。[結(jié)果]分離得到4種不同菌株，其中MD1菌株的銅耐受極限為4 000? mg/L，MD2菌株的銅耐受極限為6 000? mg/L，N1菌株的銅耐受極限為1 000 mg/L，ML菌株的銅耐受極限為8 000? mg/L。經(jīng)TAS-990F火焰原子分光光度計檢測后其對銅離子吸附能力依次為10.420、16.884、9.764、23.309? mg/g。[結(jié)論]ML菌株能較好地生成菌膠團(tuán)，可作為耐銅微生物工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌種。

關(guān)鍵詞耐銅微生物;土壤修復(fù);重金屬污染;篩選

中圖分類號S154.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0060-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.018

重金屬污染土壤中的的銅多以硫化物、硫酸鹽的形式存在，并具有隱蔽性、長期性和滯后性的特性[1]。其主要污染來源為污水灌溉、化工生產(chǎn)、礦石開采及冶煉等[2]。植物可通過根吸收土壤中的銅，在各部分累積分布，且多數(shù)為根>莖、葉>果實(shí)。但少數(shù)植物體內(nèi)銅的分布與此相反，如叢樺葉則為果>枝>葉[3]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在銅污染土壤生長的植物，含銅量為正常植物的33～50倍[4]。被植物吸附的銅可經(jīng)過食物鏈進(jìn)入人體，當(dāng)人體器官中富集、殘存了大量銅之后，容易對臟器產(chǎn)生負(fù)擔(dān)，特別是對肝臟和膽囊傷害，易于產(chǎn)生溶血性黃疸、腎功能衰竭等癥狀[5]。因此，我國于2008年修訂的《土壤質(zhì)量環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)（GB 15618—2008）》規(guī)定了土壤中銅含量不超過50 mg/kg[6]。目前銅污染土壤修復(fù)技術(shù)主要為化學(xué)試劑改良等化學(xué)方法，這些技術(shù)成本較高且易引起二次污染，故利用微生物技術(shù)治理銅污染土壤已成為研究的前沿和熱點(diǎn)[7]。

研究表明，微生物對銅的富集表現(xiàn)在其胞外絡(luò)合、胞外吸附沉淀。如類脫硫弧菌可以與重金屬產(chǎn)生難溶性的硫化物就，并通過自身代謝將硫化物排除細(xì)胞外[8]。部分微生物對銅產(chǎn)生耐性的原因是通過細(xì)胞內(nèi)的植物螯合肽和金屬結(jié)合蛋白與重金屬配位結(jié)合[9]。微生物的銅耐性也表現(xiàn)在通過與其發(fā)生氧化還原反應(yīng)，改變重金屬的價態(tài)，降低其毒性，如部分微生物會分泌一些氧化還原酶，催化重金屬的氧化還原[10]。

利用微生物治理銅污染土壤的關(guān)鍵在于獲得較高耐受性的菌株，因此目前發(fā)現(xiàn)的耐銅微生物主要為細(xì)菌、真菌和藻類。其種類繁多，吸附能力也有差異，近年來發(fā)現(xiàn)的微生物主要有黑色巨藻（Laminaria nigresense）、大杯蕈（Clitocybe maxima）、銅綠假單孢菌（Pseudomon asaeruginosa）、花斑曲霉（Aspergillus versicolor）等[11-14]。這些研究大部分集中在國外，而國內(nèi)針對銅耐性菌株的研究較少。

筆者以浙江省嘉興市嘉善地區(qū)某工廠富含銅的表層土壤作為試驗(yàn)用土，篩選分離得到銅的耐性菌株，并對其銅耐性機(jī)制進(jìn)行分析，以闡明菌株耐受銅的機(jī)制，旨在為耐銅基因和能力的精確定位提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤。供試土壤來自于嘉興市嘉善地區(qū)典型工廠附近下風(fēng)向表層土壤（0～10 cm）。采樣點(diǎn)分布見圖1。分別采集嘉興市東南風(fēng)下風(fēng)向工廠周邊9個采樣點(diǎn)的土壤，采集后用保鮮袋密封并置于4 ℃冰箱保存。分析各土壤中重金屬含量，結(jié)果2-7中土壤銅含量最高，為57 mg/kg，故該試驗(yàn)使用該采集點(diǎn)所采的土壤。

1.1.2培養(yǎng)基。

適合霉菌等真菌生長的培養(yǎng)基為馬丁氏培養(yǎng)基，其固體培養(yǎng)基配方：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g瓊脂15～20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，1/3 000孟加拉紅水溶液100 mL，水800 mL，pH自然。

適合細(xì)菌生長的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其固體培養(yǎng)基配方：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～25 g，水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

分離出的另一種放線菌使用的為馬鈴薯蛋白胨培養(yǎng)基，其制法：將含有高淀粉的馬鈴薯300 g洗凈、去皮、切片后于水浴鍋中煮沸，邊煮邊攪拌，將其過濾取濾液，每1 000 mL培養(yǎng)基加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g。液體培養(yǎng)基取其濾液每1 000 mL培養(yǎng)基加入葡萄糖20 g。各液體培養(yǎng)基配方與上述除不加瓊脂外無差異。所有培養(yǎng)基均置于高溫高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3主要儀器。

超凈工作臺、光學(xué)顯微鏡、培養(yǎng)皿、試管、涂布棒、接種環(huán)、滅菌鍋、火焰原子分光光度計TAS-990F、銅空心陰極燈等。

1.2方法

1.2.1耐銅微生物的液體初篩。

將稀釋度分別為10-1、10-2、10-3、10-4的土壤懸液置于含系列濃度梯度的重金屬銅液體培養(yǎng)基（0、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000? mg/L）中，并置于37 ℃恒溫?fù)u床下培養(yǎng)，初步篩選出具有銅耐受性的微生物。

1.2.2耐銅微生物的分離與純化。

利用平板涂布法進(jìn)行微生物的分離，用膠頭滴管吸取10 mL已長出生物膜的菌液，分別用無菌水稀釋10、100、1 000倍，采用平板涂布進(jìn)行菌株分離。

將分離菌株的培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)數(shù)日，菌株生長情況較好后進(jìn)行平板劃線，以純化菌株，為保證菌株的單一劃線進(jìn)行3次。

1.2.3耐銅微生物的鑒定。結(jié)合微生物形態(tài)分析鑒定和顯微鏡鏡檢對已分離純化的菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.4搖床不同轉(zhuǎn)速菌株生長情況。

于三角瓶中分別制備相應(yīng)培養(yǎng)基90 mL，并加入配制好的10 mL菌液，置于37 ℃恒溫?fù)u床（轉(zhuǎn)速0、30、60、90、120、150 r/min）中培養(yǎng)，并實(shí)時觀察其微生物生長情況，待進(jìn)入穩(wěn)定期測定培養(yǎng)瓶中菌膠團(tuán)平均半徑，重復(fù)3次。

1.2.5生長曲線的測定。

將耐受微生物接種至不同銅濃度（0、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 mg/L）的相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床以37 ℃、120 r/min的條件下培養(yǎng)。每隔24 h取樣，于分光光度計測定OD600，以O(shè)D600為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制不同銅濃度下耐銅菌株的生長曲線。

1.2.6吸附能力的測定。

將耐受微生物接種至相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床37 ℃、120 r/min的條件下培養(yǎng)。待耐受微生物進(jìn)入快速生長的對數(shù)生長期時，吸取上清液50 mL于50 mL離心管中，每種菌做2組，一組直接置于離心機(jī)內(nèi)以8 000 r/min離心5 min，通過過濾將沉于試管底部的微生物和重金屬收集至已稱重的濾紙上，置于105 ℃烘箱內(nèi)烘2 h，烘干后稱重。

另一組在在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，先配制王水（濃鹽酸與濃硝酸體積比為3∶1配制成），將所得下沉物質(zhì)轉(zhuǎn)移至坩堝內(nèi)置于300 ℃恒溫鐵板儀用王水消解，經(jīng)過消解的那組樣品用無菌水進(jìn)行溶解，并用無菌水定容至50 mL，保存后采用火焰原子分光光度測定，計算菌株的吸附能力，重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示;采用Excel 2016對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖;采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1液體初篩

經(jīng)過7 d的培養(yǎng)，分別發(fā)現(xiàn)在含10-2的土壤懸液、2 000 mg/L的馬丁氏液體培養(yǎng)基，含10-2的土壤懸液、1 000 mg/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，含10-2的土壤懸液、3 000 mg/L的馬鈴薯蛋白胨培養(yǎng)基中有較好的生物膜形成，且長勢較好。

2.2分離純化

于馬丁氏培養(yǎng)基中分離得到2種形態(tài)不同的菌株，分別命名為MD1、MD2，并通過平板劃線法得到單一菌株;于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中分離得到1種菌株，命名為N1;于馬鈴薯蛋白胨培養(yǎng)基中分離得到1種菌株，命名為ML菌株，同樣經(jīng)平板劃線得到單一菌株，待后續(xù)的鑒定、馴化以及特性研究。

2.3菌株初步鑒定

MD1菌株初步鑒定為黑曲霉（圖2），其形態(tài)大致分雙層，干燥，上層為孢子絲，其上已經(jīng)長出孢子，呈黑色球狀，下層基內(nèi)菌絲較黏稠但顏色較淺。MD2菌株初步鑒定為霉菌，為粉白色，干燥，上層孢子為粉色，下層基內(nèi)菌絲為白色。

N1菌株初步鑒定為革蘭氏陰性短桿菌，整體呈灰白色絮狀，難挑取，顯微觀察呈半透明短桿狀。

ML菌株初步鑒定為放線菌，乳白色，較難挑取，絨毛狀菌絲密集且細(xì)長。在顯微鏡下觀察ML菌株（圖3），發(fā)現(xiàn)菌絲形態(tài)是由垂直生長到彎曲生長并逐步向叢生發(fā)展，并存在游動的孢子[15]。

2.4菌株生長特性

對恒溫?fù)u床中的ML菌株進(jìn)行實(shí)時觀察發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)速為0 r/min的37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)下，培養(yǎng)液內(nèi)部基本無菌膠團(tuán)的形成，4 d左右在液面處長出生物膜，對比其他轉(zhuǎn)速下微生物的生長發(fā)現(xiàn)，其他轉(zhuǎn)速情況液面下均有不同程度的菌膠團(tuán)產(chǎn)生，可能為分離出的菌株均為好氧菌株導(dǎo)致。

由表1可知，當(dāng)ML菌株培養(yǎng)轉(zhuǎn)速達(dá)120 r/min后，其生長情況和菌膠團(tuán)成球能力較好，同時對比轉(zhuǎn)速150 r/min時，菌膠團(tuán)成球情況并未明顯增加，故該試驗(yàn)所分離出的菌株最適培養(yǎng)條件為37 ℃、120 r/min。

2.5菌株生長曲線

通過對OD600連續(xù)8 d的測量，繪制各菌株生長曲線，結(jié)果見圖4。由圖4可知，不同菌株在銅脅迫條件下生長趨勢不同，同時也受銅離子濃度的影響。恒溫?fù)u床37 ℃、120 r/mn培養(yǎng)下MD1菌株的銅耐受極限為4 000 mg/L，

其生長潛伏期較長，在較低銅濃度下4d后進(jìn)入對數(shù)生長期后快速到達(dá)峰值，表明此刻MD1菌株生長速率和濃度達(dá)到最高峰，培養(yǎng)液中MD1菌株的生物量也達(dá)到最大。在含7 000 mg/L馬丁氏液體培養(yǎng)基的生長曲線OD600一直在0.2附近，同時觀察培養(yǎng)基內(nèi)菌株生長情況，其內(nèi)基本未見生物膜或菌膠團(tuán)，8 000 mg/L菌株代謝生長基本無法進(jìn)行。

恒溫?fù)u床37 ℃、120 r/mn培養(yǎng)下MD2菌株的銅耐受極限為6 000 mg/L，其生長停滯期較短，培養(yǎng)1 d后即迅速進(jìn)入對數(shù)生長期，MD2菌株對數(shù)增長。在6 d左右培養(yǎng)液的OD600達(dá)到最高值，表明菌株生長速率和濃度達(dá)到最高峰，7 d后MD2菌株開始進(jìn)入衰亡期，OD600開始下降。

在恒溫?fù)u床37 ℃、120 r/mn培養(yǎng)下N1菌株的銅耐受極限為1 000 mg/L，觀察發(fā)現(xiàn)整體的N1生長曲線趨勢相似，迅速進(jìn)入對數(shù)期但受銅的毒害影響較大，其OD600一直在0.2左右。結(jié)合液體初篩和固體平板培養(yǎng)綜合分析，N1菌株的耐性高，對銅的耐性約在1 000 mg/L。

恒溫?fù)u床37 ℃、120 r/mn培養(yǎng)下ML菌株的銅耐受極限為8 000 mg/L， ML菌株在銅濃度8 000 mg/L后，其菌株的生長趨勢仍較好，通過比較各個不同銅濃度的ML菌株生長曲線發(fā)現(xiàn)，ML菌株仍受高濃度銅離子影響而生長較為緩慢。初期ML株停滯期較短，很快進(jìn)入生長期，在生長初期由于ML菌株的耐受性較強(qiáng)，故各個濃度銅離子馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的OD600值相差不大，在3 d左右，在較低濃度的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中出現(xiàn)菌落的積聚，富集了培養(yǎng)液中的菌種，故OD600稍回落。由圖4可知，ML菌株整個生長周期約8 d。鑒于試驗(yàn)時間局限性對ML菌株的馴化未能進(jìn)行，ML菌株的耐銅極限為8 000 mg/L，且長勢較好，能夠較好地生成吸附銅離子的菌膠團(tuán)。其耐受濃度與柴新義等[16]的1株銅綠微生物Cladosporium sp.的耐受性能相當(dāng)，且同樣具有形成較好菌膠團(tuán)的能力。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2019年

2.6吸附能力

為了更好地了解菌株對銅的吸附能力，取最大銅耐受極限濃度下對數(shù)生長期的上清液50 mL，分別經(jīng)離心、消解、定容制成待測樣品，并于火焰原子分光光度計TAS-990F進(jìn)行吸附能力檢測。由表2可知，50 mL樣品中各菌

株對重金屬銅的吸附量均在20 mg左右，結(jié)合50 mL中樣品

菌干重分析，MD2菌株、 ML菌株的菌干重較小，其單位生物量的吸附能力則較強(qiáng)，并通過計算得圖5。由圖5可知，MD1菌株吸附能力為10.420 mg/g，MD2菌株吸附能力為16.884 mg/g，N1菌株吸附能力為9.764 mg/g，ML菌株吸附能力為23.309 mg/g。結(jié)合各菌株的耐受極限分析，N1菌株的耐受極限和吸附能力綜合表現(xiàn)最弱，但N1菌落初步鑒定為細(xì)菌，

可作為耐銅細(xì)菌吸附能力研究的試驗(yàn)菌種。ML菌株的耐受極限為8 000 mg/L，其吸附能力為23.309 mg/g，是該試驗(yàn)中分離出的4種菌株中最強(qiáng)的，且其菌落形成菌膠團(tuán)的能力強(qiáng)、時間快。對比MD1菌株和MD2菌株發(fā)現(xiàn)，這2種菌株均為馬丁氏培養(yǎng)基中分離出的霉菌，但MD2菌株的耐受極限及吸附能力較MD1菌株高。

楊帥等[17]于安徽某銅礦區(qū)發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陽氏菌株的耐受極限為200 mg/L，相較該試驗(yàn)于浙江嘉興地區(qū)所分離出的菌株，其耐受極限較低。分析其原因，浙江嘉興地區(qū)為酸性土壤，同時土壤采集地為金屬加工工廠附近，污染較為嚴(yán)重，已經(jīng)對本土菌株進(jìn)行了一定的馴化。

同時對比同為浙江地區(qū)董新姣等[18]2003年發(fā)現(xiàn)的銅綠假單胞菌的耐受性，其耐受極限為560 mg/L，發(fā)現(xiàn)隨著我國工業(yè)化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，土壤中重金屬含量的積累，微生物受馴化其耐受性也隨之增加，吸附能力也相應(yīng)增加。

3結(jié)論與討論

（1）微生物修復(fù)為重金屬污染修復(fù)土壤提供了較傳統(tǒng)物理、化學(xué)法更為高效、綠色的方法，其修復(fù)潛力巨大[19]。該研究從典型重金屬土壤中成功分離出4種不同耐銅菌株，初步鑒定菌株類型并測定其其生長曲線及吸附能力，確定菌株的生長特性、條件及對銅的吸附能力，初步鑒定菌株MD1、MD2、N1、ML分別為黑曲霉、霉菌、桿狀菌、放線菌。探索了耐性微生物的篩選、分離的機(jī)理，擴(kuò)充了耐性微生物的種類，對菌株運(yùn)用于含銅土壤的修復(fù)提供依據(jù)。

（2）現(xiàn)階段雖已有耐銅微生物的報道，但其耐受性不強(qiáng)：Pseudomonadaceae USTB-E 560 mg/L[20]、Aspergillus fumigatus 940 mg/L[21]、Rhizopus 1 920 mg/L[22]。該研究從典型重金屬土壤中成功分離出4種不同的耐銅菌株MD1、MD2、N1、ML銅耐受極限分別為4 000、6 000、1 000、8 000 mg/L;吸附強(qiáng)度分別為10.420、16.884、9.764、23.309 mg/g，為已發(fā)現(xiàn)耐銅微生物中較優(yōu)質(zhì)的菌株。

（3）ML菌株的耐受極限達(dá)8 000 mg/L，吸附性能為23.309 mg/g，與已報道的銅綠微生物Cladosporium sp[16]相似，且ML菌株的吸附性能更強(qiáng)，其在搖床37 ℃、120 r/min下形成的菌膠團(tuán)半徑更大，其長勢較好，易于后續(xù)土壤修復(fù)的工業(yè)化生產(chǎn)。

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