蔣瑩 程永樂 曹代京 陳有君 李國光 閆偉

摘要為了探明環(huán)境pH對褐環(huán)粘蓋牛肝菌（Suillus luteus（L.：Fr.）Gray）生長代謝的影響機理，研究不同pH條件下液體培養(yǎng)褐環(huán)粘蓋牛肝菌菌絲中蛋白質和核酸的含量變化，結果顯示：該菌在pH 3.0～6.0范圍內，隨著pH的增加，蛋白質及核酸的含量逐漸增加，并在pH 6.0時達到最高值;在pH 6.0～8.0范圍內，蛋白質及核酸的含量迅速降低。蛋白質的含量和RNA、DNA的含量之間極顯著相關，相關系數(shù)分別達0.923和0.977，DNA和RNA的含量之間也極顯著相關，相關系數(shù)達0.927。該研究可為進一步探索褐環(huán)粘蓋牛肝菌適應與調節(jié)環(huán)境pH機理方面提供依據(jù)。

關鍵詞褐環(huán)粘蓋牛肝菌;pH;蛋白質;核酸

中圖分類號S646.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2019）02-0004-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.002

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

褐環(huán)粘蓋牛肝菌（Suillus luteus（L.：Fr.）Gray）是分布于我國甘肅、內蒙古[1]、陜西、黑龍江、西藏、遼寧以及廣東等地的外生菌根真菌，不同地區(qū)土壤的酸堿度不同導致菌絲體的生長狀況不盡相同[2-3]，所以環(huán)境pH對該菌的影響引發(fā)大量學者的研究討論。張茹琴等[4]發(fā)現(xiàn)該菌的最適生長pH為5.3～6.7，且培養(yǎng)后培養(yǎng)基的pH降低。雷增普等[5]通過大田試驗發(fā)現(xiàn)，該菌具有抗堿能力（土壤pH 8.6）。姚慶智等[6]發(fā)現(xiàn)該菌在pH 6～7時生長最為旺盛。宋微等[7]研究發(fā)現(xiàn)，該菌在pH 4.0～8.0的固體培養(yǎng)基上能生長，且最適pH為5.0，在pH小于5.0或者大于6.0時，該菌的增長速度減緩，菌苔變薄。劉淑清等[8]通過試驗發(fā)現(xiàn)，含有檸檬酸-磷酸二氫鉀緩沖液且pH為4.5的培養(yǎng)基中該菌的生物量最高，當pH大于4.5時，菌絲的生物量隨著pH的增高而逐漸降低[8]。劉強等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在NaCl濃度為0.1 mol/L且pH為6.0時，該菌長勢最好，隨著環(huán)境pH的增加，菌體受到的抑制作用也愈加明顯。劉楊[10]研究不同培養(yǎng)基、pH、碳氮源等因素對該菌的影響，發(fā)現(xiàn)該菌在Pach培養(yǎng)基上的最適生長pH為4.5。王明慧[11]發(fā)現(xiàn)該菌的蛋白含量隨著pH的升高而升高，在pH為5.0時增長速率最大，且在pH 7.0時蛋白含量達到最大值，達到峰值后蛋白質含量迅速下降。劉萌[12]發(fā)現(xiàn)該菌在pH 5.0～6.0時分泌的有機酸最多，生長狀況最好。但是，環(huán)境pH對該菌核酸含量的影響還缺少研究。

通過對多種絲狀真菌的研究發(fā)現(xiàn)，生物響應外界環(huán)境酸堿性的改變是通過自身基因表達的改變來實現(xiàn)的[13]。嗜水氣單胞菌在中性或偏酸性（pH 7.0和pH 5.0）環(huán)境中，4種毒性基因可以表達，而在堿性環(huán)境中僅僅只有1種基因可以表達[14]。賈海鋒等[15]通過不同pH處理草莓果實葉片的試驗，發(fā)現(xiàn)隨著pH的增加基因表達量呈顯著上升趨勢，并在pH 6時獲得最大值。沈靜等[16]發(fā)現(xiàn)低pH嚴重影響水稻根系細胞中細胞膜質子泵基因的表達，在pH 5.5時該基因的表達量最高。有研究表明，細胞膜質子泵的最高活性范圍為pH 6.0～6.5[17-18]，pH通過影響其活性進而影響其表達量。以上說明環(huán)境pH會對生物體的基因產生影響。雖然部分研究學者針對pH與褐環(huán)粘蓋牛肝菌之間的關系做了大量研究，但從蛋白質及核酸含量方面研究該菌與環(huán)境pH之間關系的報道目前還不是很多。筆者研究了該菌在不同pH培養(yǎng)下蛋白質和核酸的含量變化，以期為深入了解褐環(huán)粘蓋牛肝菌生理學及其改變環(huán)境pH的調控機制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗處理

將在Pach培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d的褐環(huán)粘蓋牛肝菌Sp9菌株（由內蒙古農業(yè)大學菌根技術研究室提供）轉接到不同pH（滅菌后pH為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0）的液體培養(yǎng)基中，每瓶接入11塊，150 mL三角瓶裝液量為50 mL，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，并每天更換其培養(yǎng)基，5 d后濾出菌絲，備用。

1.2試驗方法

1.2.1蛋白質的測定。

取0.01 g菌絲用液氮冷卻后于冰浴中進行研磨，加入1 mL研磨緩沖液后裝入離心管中于-4 ℃、6 000 r/min條件下離心5 min。取上清液，再次置于離心管中，并于-4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，獲得上清液。用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量（以牛血清蛋白溶液為標準液，用考馬斯亮藍法做標準曲線：y=85.816x-1.098 6，其中x為吸光度，y為蛋白質含量，線性相關系數(shù)r為0.999，根據(jù)標準曲線計算出8個樣品中相應蛋白質的含量）。

1.2.2RNA含量的測定。取0.01 g菌絲用液氮冷卻后在冰浴中充分研磨至粉末，按照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根公司）所提供的方法提取該菌的總RNA，并溶于ddH2O中，取1 μL RNA ddH2O溶液于Biodrop中檢測RNA含量。

1.2.3DNA含量的測定。取0.01 g菌絲用液氮冷卻后于冰浴中充分研磨至粉末，按照植物基因組DNA提取試劑盒（天根公司）所給的方法提取該菌的總DNA，并溶于ddH2O。取1 μL DNA ddH2O溶液于Biodrop中進行DNA含量檢測。

2結果與分析

2.1pH對褐環(huán)粘蓋牛肝菌蛋白質含量的影響

不同環(huán)境pH培養(yǎng)5 d后菌絲體的蛋白含量如圖1所示。由圖1可知，當pH小于6時，蛋白質含量隨著pH的升高而逐漸上升，在pH為3.0～4.5時，蛋白質的含量上升緩慢，每增加1個單位的pH，蛋白質平均增加215.79 ng;在pH 4.5～5.0范圍內，單位pH的蛋白質增長量極其微小，僅增加43.07 ng;在pH為5.0～6.0時，蛋白質含量迅速增長，單位pH的蛋白質增長量高達714.35 ng，且在pH 6.0時蛋白質的含量達到最高值;達到峰值后，隨著pH的增加，蛋白質含量逐漸降低，在pH為6.0～8.0時，蛋白質含量顯著下降，單位pH的蛋白質減少量達到330.59 ng。就整體趨勢而言，蛋白質含量受環(huán)境pH的影響較大，在pH 6.0的條件下，蛋白質含量最高，推測pH 6.0為該菌的最適生長pH。

2.2pH對褐環(huán)粘蓋牛肝菌RNA含量的影響

不同環(huán)境pH培養(yǎng)5 d后菌絲體的RNA含量如圖2所示。由圖2可知，當pH小于6時，RNA含量隨著pH的升高而升高，在pH為3.0～4.5時，RNA含量增長緩慢，環(huán)境pH每增加1個單位，RNA含量增加77.30 ng;在pH為4.5～6.0時，RNA含量顯著增加，平均環(huán)境pH每增加1個單位，RNA含量的增長量可達283.79 ng，并在pH 6.0時達到峰值，為639.60 ng/mg。此后，隨著pH的增加，RNA含量開始下降，在pH為6.0～7.0時，RNA含量逐漸減少，單位減少量為150.38 ng;在pH為7.0～8.0時，RNA含量迅速下降，單位pH的RNA減少量達到313.16 ng，說明在堿性環(huán)境下不利于RNA的合成。就整體趨勢而言，環(huán)境pH對RNA含量影響較大，RNA含量在pH 6.0時獲得最大值，因此推測該菌的最適生長pH為6.0。

2.3pH對褐環(huán)粘蓋牛肝菌DNA含量的影響

不同環(huán)境pH培養(yǎng)5 d后菌絲體的DNA含量如圖3所示。由圖3可知，當pH小于6.0時，DNA含量隨著pH的升高而逐漸上升，在pH為3.0～4.0時，DNA含量增長緩慢，單位pH的DNA增加量為62.44 ng;在pH 4.0～4.5時DNA含量幾乎不變;在pH 4.5～6.0時，DNA含量顯著增加，單位pH的DNA增加量可達90.23 ng，并在pH 6.0時DNA含量達到最大值;在pH 6.0～8.0時，DNA含量快速下降，單位pH的DNA減少量可達59.21 ng。就整體變化趨勢而言，DNA含量受環(huán)境pH影響較大，DNA含量在pH 6.0時最高，因此推測該菌的最適生長pH為6.0。

3結論與討論

3.1褐環(huán)粘蓋牛肝菌蛋白質含量與RNA含量的相關性

由圖4可以看出，蛋白質含量隨RNA含量的增加而增加，相關分析表明二者之間具有極顯著的相關關系（相關系數(shù)r=0.923，P<0.01）。菌絲中蛋白質含量與RNA含量的線性回歸方程為y=1.5722x+1 832.1。

通過對圖1和圖2進行對比發(fā)現(xiàn)，在pH 3.0～6.0的培養(yǎng)條件下，蛋白質與RNA的含量都隨著pH的升高而逐漸上升，其中在pH 3.0～4.5時，RNA含量的增加速率明顯高于蛋白質含量的增長速率，單位菌絲體中平均1 ng RNA可以翻譯為14.859 ng蛋白質;在pH 4.5～6.0時，蛋白質含量增長率高于RNA含量增長率，單位菌絲體中平均1 ng RNA可以翻譯為6.441 ng蛋白質，雖然翻譯率下降，但由于轉錄率較高，獲得的RNA含量較高，所以依然獲得較高的蛋白質含量，并在pH 6.0的培養(yǎng)條件下蛋白質含量達到峰值，說明在該pH范圍內更利于蛋白質的合成;在pH 6.0～8.0的培養(yǎng)條件下，二者的含量都明顯下降，單位菌絲體中平均1 ng RNA可以翻譯為7.732 ng蛋白質，雖然翻譯率有所提高，但由于該范圍的環(huán)境pH培養(yǎng)條件下RNA的合成量逐漸降低，因此翻譯獲得的蛋白質含量依然呈下降趨勢，尤其在pH 7.0～8.0時，RNA含量的下降速率比蛋白質的下降速率更大。

3.2褐環(huán)粘蓋牛肝菌蛋白質含量與DNA含量的相關性

由圖5可以看出，蛋白質含量隨DNA含量的增加而增加，相關分析表明二者之間具有極顯著的相關關系（相關系數(shù)r=0.977，P<0.01）。菌絲中蛋白質含量和DNA含量的線性回歸方程為y=5.452 4x+1 466.9。

通過對圖1和圖3進行對比發(fā)現(xiàn)，在pH 3.0～6.0的培養(yǎng)條件下，蛋白質和DNA的含量都隨著pH的增加而增加，其中在pH 3.0～4.5時，DNA的增長率接近蛋白質增長率的7倍，說明在該pH范圍內，更有利于DNA的合成，單位基因的表達量不大，導致蛋白質含量的增加速率緩慢，但是在pH 4.5～6.0 的培養(yǎng)條件下，蛋白質的增長率迅速增加，即基因的表達量顯著增加，說明在該pH范圍內更有利于基因的表達。在pH 6.0～8.0的培養(yǎng)條件下，二者含量均顯著下降，其中，在pH 6.0～7.0時，DNA含量的減少率明顯高于蛋白質含量的減少率，說明在該環(huán)境pH下更不利于DNA的生成;在pH 7.0～8.0時，二者含量均繼續(xù)下降接近于最低值，說明在堿性條件下不利于該菌基因的表達。

3.3褐環(huán)粘蓋牛肝菌RNA含量與DNA含量的相關性

由圖6可知，RNA含量隨DNA含量的增加而增加，相關分析表明二者之間具有極顯著的相關關系（相關系數(shù)r=0.927，P<0.01）。菌絲中RNA含量與DNA含量線性回歸方程為y=3.037 1x-161.93。

通過對圖2和圖3進行綜合分析，可以發(fā)現(xiàn)，在pH 3.0～4.5的培養(yǎng)條件下，單位菌絲體中平均1 ng DNA可以轉錄為1.443 ng RNA;在pH 4.5～6.0的培養(yǎng)條件下，單位菌絲體中平均1 ng DNA可以轉錄為2.254 ng RNA，轉錄率有所提高，并在pH 6.0的培養(yǎng)條件下獲得最高RNA含量;在pH 6.0～8.0的培養(yǎng)條件下，單位菌絲體中平均1 ng DNA可以轉錄為1.956 ng RNA，轉錄率有所下降，說明該范圍的環(huán)境pH下，不利于RNA的合成。

綜上所述，在pH 3.0～6.0的培養(yǎng)條件下，褐環(huán)粘蓋牛肝菌菌絲體中蛋白質和核酸的含量都隨著pH的增加而逐漸增加，并在pH 6.0時獲得峰值，此后隨著pH的增加其含量均顯著降低。該結果與孫琳[19]、蔡楠楠[20]在pH 6.0獲得最大生物量的結果相吻合，因此，可以認為弱酸性環(huán)境下更有利于褐環(huán)粘蓋牛肝菌的生長，并且該菌的最適生長pH為6.0。

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