賈繼陽(yáng) 徐 奭 申蘭蘭 張耀川 張海嬌 白素蘭**

(1. 首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048； 2. 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院園藝系，北京 102442)

0 引 言

等溫滴定量熱技術(shù)(ITC)是通過(guò)檢測(cè)分子相互作用所釋放或吸收的能量，通過(guò)單次滴定實(shí)驗(yàn)即可提供完整的熱動(dòng)力學(xué)信息，直接提供結(jié)合常數(shù)，化學(xué)計(jì)量比及反應(yīng)焓變，揭示蛋白質(zhì)分子間特異性相互作用[1]．ITC技術(shù)的特點(diǎn)是需要的樣品量非常小且無(wú)需任何化學(xué)修飾或標(biāo)記，其能夠檢測(cè)的親和力范圍從100 μmol/L到1 nmol/L[2]．高質(zhì)量的ITC數(shù)據(jù)需要經(jīng)過(guò)樣品制備，滴定實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析及實(shí)驗(yàn)優(yōu)化幾個(gè)步驟才可能獲得．幾乎所有蛋白質(zhì)類(lèi)型的樣品和幾乎所有的緩沖液體系均可用于ITC實(shí)驗(yàn)，但是滴定物的稀釋熱量或?qū)φ諢崃考暗味ㄎ锱c被滴定物的緩沖液體系是否匹配對(duì)ITC實(shí)驗(yàn)的成功與否起到至關(guān)重要的作用．當(dāng)?shù)味ㄎ锉坏味ǖ綐悠烦刂械木彌_液中混勻后，就會(huì)產(chǎn)生結(jié)合熱之外的其他熱量，稱(chēng)為稀釋熱量或?qū)φ諢崃浚粋€(gè)ITC實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵就是要盡量減小對(duì)照熱量，使得結(jié)合熱量能夠被測(cè)定得更加準(zhǔn)確．如果對(duì)照熱量非常小且恒定，先用滴定樣品的數(shù)據(jù)扣除平均對(duì)照熱量，之后就可以進(jìn)行曲線擬合以獲得結(jié)合參數(shù)．造成對(duì)照熱過(guò)大有兩個(gè)主要原因，一個(gè)是滴定物與樣品池中的大分子樣品緩沖液不匹配；另一個(gè)是過(guò)高的滴定物濃度．最常見(jiàn)的緩沖液不匹配是由滴定物和大分子溶液pH值的差異造成的．對(duì)于不匹配的滴定物與被滴定物，樣品制備的關(guān)鍵就是通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾進(jìn)行緩沖液置換，以確保滴定物和被滴定物的溶液完全匹配才能保證稀釋熱完全合格[3]．

擬南芥中控制根毛發(fā)生的關(guān)鍵蛋白包括CAPRICE(CPC)和GLABRA3(GL3)，當(dāng)CPC與GL3互作形成蛋白質(zhì)復(fù)合體時(shí)，抑制下游基因GLABRA2(GL2)表達(dá)，促進(jìn)表皮細(xì)胞發(fā)育為根毛細(xì)胞[4]．雖然已經(jīng)有酵母雙雜交結(jié)果證明CPC蛋白和GL3蛋白會(huì)發(fā)生相互作用[5]，但是與其它檢測(cè)體外蛋白相互作用的實(shí)驗(yàn)方法一樣也存在著假陽(yáng)性結(jié)果的可能．等溫滴定量熱技術(shù)靈敏度高，適用范圍廣，測(cè)定結(jié)果更加精確可靠，目前已被作為測(cè)量分子之間相互作用的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[6]．本研究通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)、分離純化，得到了溶解在咪唑緩沖液中的蛋白質(zhì)樣品CPC和溶解在還原型谷胱甘肽緩沖液中的蛋白質(zhì)樣品GL3，在進(jìn)行ITC滴定之前進(jìn)行磷酸緩沖液置換使得滴定物與被滴定物緩沖液匹配，獲得了準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果．為今后利用等溫滴定量熱儀研究蛋白相互作用提供了理論依據(jù)．

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

透析膜(型號(hào) 66012，美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，臺(tái)式全溫振蕩器(THZ-C-1，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，多用途高速冷凍離心機(jī)(1580R，中國(guó)香港基因有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(CR22G Ⅲ，日本日立集團(tuán))，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY92-2D，寧波新芝生物科技股份有限公司)，紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(Ultrospec 3100pro，美國(guó)GE公司)，馬爾文微量熱等溫滴定量熱儀(MicroCal iTC200，英國(guó)馬爾文儀器有限公司)．

1.2 原核蛋白表達(dá)和純化

CPC蛋白的表達(dá)和純化：將含有CPC-His融合蛋白的大腸桿菌(pET-28a載體BL21感受態(tài)，北京全式金生物技術(shù)有限公司)培養(yǎng)在含有50 g/mL 卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中，置于37℃，200 轉(zhuǎn)/min，搖床中孵育，培養(yǎng)至光密度(OD)值為一定值時(shí)，即OD600 nm=0.6～0.8時(shí)，加入1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃誘導(dǎo) 5 h．將菌液離心，破碎后與Ni-NTA混合于4℃結(jié)合4 h，將混合液倒入重力柱中，先用低濃度50 mmol/L咪唑溶液洗去非特異性結(jié)合的蛋白，后用高濃度300 mmol/L 咪唑溶液洗脫并收集目標(biāo)蛋白．

GL3蛋白的獲取方法：將含有GL3-GST融合蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)在含有50 g/mL 氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，置于37℃，200 轉(zhuǎn)/min的搖床中培養(yǎng)至OD600 nm=0.6～0.8時(shí)，加入1 mmol/L的IPTG，換至16℃誘導(dǎo)10 h．將菌液離心，破碎后與谷胱甘肽瓊脂糖珠子混合于4℃結(jié)合4 h，將混合液倒入重力柱中，先用2 mmol/L還原性谷胱甘肽溶液洗去非特異性結(jié)合的蛋白，然后用10 mmol/L 還原性谷胱甘肽溶液洗脫并收集目標(biāo)蛋白．

1.3 蛋白質(zhì)透析

利用透析袋對(duì)兩種不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行透析來(lái)置換成相同濃度的磷酸緩沖液(PBS)體系．將純化得到的CPC-His和GL3-GST分別放于截留分子量為 5 000和20 000的透析袋中，將透析袋分別放于相同濃度的PBS緩沖液(pH 7.4)中，在4℃進(jìn)行靜置透析10 h．

1.4 蛋白質(zhì)濃縮

將裝有透析樣品的透析袋放于4℃，把PEG 20 000均勻鋪灑在透析袋上進(jìn)行蛋白質(zhì)濃縮．

1.5 等溫滴定實(shí)驗(yàn)

將未透析或透析后的樣品放在等溫滴定量熱儀iTC200的滴定針中，將緩沖液放于樣品池中，溫度設(shè)定為25℃．除第1滴溶液的滴定體積為0.4 μL，其余19滴分別為每150 sec滴定2 μL體積．

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 儀器穩(wěn)定性測(cè)量

使用超純水滴定超純水進(jìn)行儀器性能穩(wěn)定性測(cè)試，參考功率設(shè)定為 5 μW，儀器穩(wěn)定性結(jié)果如圖1所示．基線漂移從5.06～5.11 μW，符合(5.0±0.5)μW的要求．最大幅度為第12滴，約0.05 μW，小于0.05～0.06μW的要求．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，每一滴水滴清晰，滴定質(zhì)量好，樣品池清潔，儀器性能好，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)．

圖1 水滴水實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 CPC蛋白質(zhì)樣品透析優(yōu)化

為了確定樣品溶液對(duì)蛋白質(zhì)相互作用是否有影響，分別對(duì)未透析樣品和透析樣品進(jìn)行滴定過(guò)程釋放熱量進(jìn)行測(cè)量．透析樣品前處理過(guò)程是將CPC蛋白樣品在PBS緩沖液中進(jìn)行透析．磁力攪拌雖會(huì)增加透析速度減少透析時(shí)間，但是也會(huì)造成CPC蛋白發(fā)生沉淀．由于ITC技術(shù)只適用于檢測(cè)液體樣本，沉淀樣本無(wú)法利用ITC進(jìn)行檢測(cè)，因此，本研究透析過(guò)程采用靜置透析．

用未透析 CPC蛋白溶液滴定PBS緩沖液，滴定過(guò)程釋放的熱量值如圖2所示．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，滴定過(guò)程首先發(fā)生的是一個(gè)明顯的放熱反應(yīng)，最大幅度為第2滴，為22.5 μW，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.2 μW稀釋熱的合格標(biāo)準(zhǔn)(對(duì)應(yīng)的積分面積為-335.4 μW.sec)．之后在第8、9滴反應(yīng)趨于飽和，繼而轉(zhuǎn)化為一個(gè)幅度基本相同的吸熱反應(yīng)，幅度約為1.25 μW，>0.2 μW稀釋熱的合格標(biāo)準(zhǔn)，直到第20滴(對(duì)應(yīng)的積分面積為14.48 μW.sec)．

圖2 未透析CPC蛋白質(zhì)樣品滴定反應(yīng)熱量釋放

未透析CPC蛋白質(zhì)樣品滴定摩爾ΔH如圖3所示，結(jié)果顯示滴定針中的蛋白質(zhì)樣品和樣品池中的緩沖液發(fā)生了明顯的相互作用，造成過(guò)高的對(duì)照熱量(稀釋熱)，這是由于滴定針中的蛋白質(zhì)樣品溶解在咪唑溶液中，與樣品池中的PBS緩沖液不匹配造成的．

圖3 未透析CPC蛋白質(zhì)樣品滴定摩爾焓變

透析后CPC蛋白質(zhì)樣品滴定PBS緩沖液，透析后CPC蛋白質(zhì)樣品滴定反應(yīng)熱量釋放如圖4所示．最大幅度為第3滴，約0.11 μW；第19滴幅度最小，約為0.05 μW，<0.2 μW稀釋熱的標(biāo)準(zhǔn)，且全部20滴的雙向正負(fù)峰一致．

圖4 透析后CPC蛋白質(zhì)樣品滴定反應(yīng)熱量釋放

透析后CPC蛋白質(zhì)樣品滴定摩爾ΔH如圖5所示，結(jié)果顯示絕對(duì)熱量變化很低．因此，透析樣品能夠提高ITC測(cè)定結(jié)果的可靠性．

圖5 透析后CPC蛋白質(zhì)樣品滴定摩爾焓變

2.3 GL3蛋白質(zhì)透析前后滴定PBS緩沖液

用未透析GL3蛋白質(zhì)溶液滴定PBS緩沖液，滴定過(guò)程釋放的熱量值如圖6所示．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，滴定過(guò)程發(fā)生的是一個(gè)明顯的放熱反應(yīng)，最大幅度為第2滴，為35 μW，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.2 μW稀釋熱的合格標(biāo)準(zhǔn)(對(duì)應(yīng)的積分面積為-539.5 μW.sec)，反應(yīng)在最后幾滴(18～20)趨于飽和(第20滴對(duì)應(yīng)的峰面積為-10.2μW.sec)．和放熱反應(yīng)同時(shí)存在的是一個(gè)較小的吸熱反應(yīng)，反應(yīng)最大幅度在第2滴，為1.25 μW，>0.2 μW稀釋熱的合格標(biāo)準(zhǔn)，在第9滴反應(yīng)趨于飽和．

圖6 未透析GL3蛋白質(zhì)樣品滴定反應(yīng)熱量釋放

未透析GL3蛋白質(zhì)樣品滴定摩爾ΔH如圖7所示，結(jié)果均表明滴定針中的蛋白質(zhì)樣品和樣品池中的緩沖液發(fā)生了明顯的相互作用，造成過(guò)高的對(duì)照熱量(稀釋熱)，這是由于滴定針中的蛋白質(zhì)樣品與樣品池中的PBS緩沖液不匹配造成的．

圖7 未透析GL3蛋白質(zhì)樣品滴定摩爾焓變

然后采用CPC蛋白質(zhì)透析成功的方法對(duì)GL3蛋白質(zhì)進(jìn)行透析．不使用磁力攪拌器，使透析緩和，防止過(guò)度透析產(chǎn)生沉淀；使靜置時(shí)間延長(zhǎng)從而延緩整個(gè)透析時(shí)間．這樣透析后的GL3蛋白質(zhì)樣品很均一，未發(fā)生沉淀，其滴定PBS緩沖液相關(guān)熱量釋放結(jié)果如圖8所示．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，滴定過(guò)程發(fā)生的是一個(gè)放熱反應(yīng)，最大幅度第3滴為2.05 μW，>0.2 μW 稀釋熱的合格標(biāo)準(zhǔn)，第20滴幅度最小，為1.0 μW．雖然較未透析的GL3蛋白質(zhì)稀釋熱有非常明顯的改善，反應(yīng)最終也未達(dá)到飽和，說(shuō)明透析產(chǎn)生一定的效果，但原始滴定曲線仍體現(xiàn)出滴定針中的蛋白質(zhì)樣品和樣品池中的緩沖液有一定的相互作用的趨勢(shì)，整個(gè)反應(yīng)高于稀釋熱的標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明此種適用于類(lèi)CPC蛋白質(zhì)透析的方法并不適用于GL3蛋白質(zhì)．這是由于透析不徹底導(dǎo)致的．

圖8 透析中GL3蛋白質(zhì)樣品滴定反應(yīng)熱量釋放

為了獲得可靠的滴定結(jié)果，本研究改變了對(duì)GL3蛋白質(zhì)透析方法．在GL3蛋白質(zhì)透析過(guò)程中使用磁力攪拌器進(jìn)行透析，透析過(guò)程中未發(fā)生沉淀現(xiàn)象，獲得了均一穩(wěn)定的GL3蛋白質(zhì)．透析后GL3蛋白質(zhì)樣品滴定PBS緩沖液，相關(guān)熱量釋放結(jié)果如圖9 所示．最大幅度為第二滴，<0.05 μW，接近水滴水，<0.2 μW 稀釋熱的標(biāo)準(zhǔn)．此結(jié)果說(shuō)明透析完全合格，此種透析方式適用于GL3蛋白質(zhì)．

圖9 透析后GL3蛋白質(zhì)樣品滴定反應(yīng)熱量釋放圖

2.4 透析后CPC與GL3蛋白質(zhì)相互作用測(cè)量

使用透析后濃度為68 μmol/L的GL3蛋白質(zhì)溶液滴定濃度為22 μmol/L的CPC蛋白質(zhì)溶液．該滴定反應(yīng)以放熱成分為主，由于釋放熱量?jī)H為微瓦(μW)級(jí)別，不會(huì)造成蛋白質(zhì)樣品變性．點(diǎn)對(duì)點(diǎn)扣減背景數(shù)據(jù)后，采用順序結(jié)合模型進(jìn)行擬合．當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為2時(shí)，擬合曲線及結(jié)果合理．由熱動(dòng)力學(xué)結(jié)果可知，在PBS緩沖液中，透析后的GL3和CPC這兩個(gè)蛋白質(zhì)至少存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)并很可能是以順序結(jié)合的方式相互作用．第1個(gè)和第2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的解離平衡常數(shù)Kd分別為(3.2±0.2)和(16.7±0.9)μmol/L，由此可以初步判斷：在第1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)兩個(gè)蛋白質(zhì)相互作用的親和力高于第2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)．由等溫滴定量熱技術(shù)所測(cè)定出的ΔH及ΔS的絕對(duì)數(shù)值不一定準(zhǔn)確，但其正負(fù)符號(hào)是準(zhǔn)確的．從ΔH和ΔS的結(jié)果來(lái)看，二者都是由焓驅(qū)動(dòng)的過(guò)程(ΔH<0)，都發(fā)生了不利的熵的補(bǔ)償效應(yīng)(ΔS<0)．具體來(lái)看，第1個(gè)和第2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的ΔH分別為(-160.3±1.1)和(-566.3±18.2) kcal/mol，ΔH<0表明在兩個(gè)蛋白質(zhì)之間可能形成了氫鍵、離子鍵、范德華力等非共價(jià)鍵，這些因素都是有利于GL3和CPC這兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合的．第1個(gè)和第2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的-TΔS分別為152.7和560.5 kcal/mol，其中T為開(kāi)爾文溫度(T=273.15+反應(yīng)溫度，此處ITC實(shí)驗(yàn)反應(yīng)溫度為25℃)．-TΔS>0,由此可知ΔS<0，這表明在兩個(gè)蛋白結(jié)合過(guò)程中，某個(gè)蛋白質(zhì)很有可能還發(fā)生了構(gòu)像變化，這會(huì)使得分子的自由度下降，是不利于GL3和CPC兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合的因素．由以上測(cè)定結(jié)果初步判斷GL3和CPC蛋白有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)．該結(jié)果與已發(fā)表的研究結(jié)果相比更加精確，已有研究只是報(bào)道CPC蛋白和GL3蛋白間有相互作用，而沒(méi)有報(bào)道有幾個(gè)相互作用位點(diǎn)．

3 討 論

ITC是研究分子間相互作用的一種可靠方法[7]．ITC研究一個(gè)經(jīng)典的應(yīng)用就是在結(jié)構(gòu)信息已經(jīng)明確的情況下，研究體現(xiàn)廣闊生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)和配體相互作用的結(jié)構(gòu)和熱動(dòng)力學(xué)之間潛在的關(guān)系．這對(duì)于理解生物分子相互作用及優(yōu)化配體結(jié)合的親和力都非常重要．此外，ITC能夠提供精確的結(jié)合熱動(dòng)力學(xué)，因此特別適用于藥物設(shè)計(jì)，能夠優(yōu)化藥物及靶點(diǎn)的相互作用，促進(jìn)發(fā)展?jié)撛谛孕滦陀行幬镉糜谖磥?lái)臨床應(yīng)用．

對(duì)于一個(gè)完整的等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)，從樣品制備到滴定實(shí)驗(yàn)受很多因素的影響，其中緩沖液體系的匹配就是影響因素之一．ITC實(shí)驗(yàn)要求滴定物與被滴定物的緩沖液體系必須匹配，包括緩沖液的成分，pH值及鹽濃度等．極其微小的pH值，NaCl鹽濃度的差異，會(huì)導(dǎo)致極大的背景噪音熱信號(hào)，即稀釋熱，從而干擾分子間相互作用的特異性信號(hào)．對(duì)緩沖液不匹配的兩種蛋白質(zhì)可以通過(guò)透析的方式進(jìn)行緩沖液置換[8]．

本研究采用擬南芥中兩種不同類(lèi)型的蛋白質(zhì)，CPC蛋白和GL3蛋白，進(jìn)行不同方式的透析，利用ITC分別檢測(cè)不同處理的樣品分子的稀釋熱，結(jié)果表明對(duì)不同類(lèi)型的蛋白質(zhì)需要采用不同的透析方法才能達(dá)到最佳的效果，最大程度地減少噪音．對(duì)于小分子量蛋白宜采用緩慢透析的方法透析防止透析過(guò)度，而對(duì)于分子量比較大的蛋白宜采用快速透析的方法透析防止透析不徹底．通過(guò)ITC初步判斷GL3和CPC蛋白質(zhì)有兩個(gè)相互作用結(jié)合位點(diǎn)．已有研究只是報(bào)道CPC蛋白和GL3蛋白間有相互作用，而沒(méi)有報(bào)道有幾個(gè)相互作用位點(diǎn)，該結(jié)果與已有的研究結(jié)果相比更加精確．

ITC是一種可靠的、快速檢測(cè)蛋白之間相互作用的技術(shù)手段．對(duì)應(yīng)用該技術(shù)方法的優(yōu)化為今后檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)．