吳映璇，林 峰，陳思敏

（廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510623）

近年來頻繁發(fā)生的乳與乳制品的質(zhì)量安全事件引起人們對(duì)乳制品安全的普遍關(guān)注，特別是獸藥殘留問題[1-6]。寄生蟲感染是危害畜禽生產(chǎn)和畜牧業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，其防治以藥物為主。常用的防治藥物主要為苯并咪唑類藥物、咪唑噻唑類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物等[6-8]，隨著藥物的廣泛使用，不可避免的出現(xiàn)了耐藥性問題[9-10]。莫奈太爾是一種新型氨基乙腈衍生物類驅(qū)蟲藥，經(jīng)口給藥后，在動(dòng)物體內(nèi)被快速吸收并快速氧化為亞砜，亞砜又進(jìn)一步被氧化為砜，莫奈太爾及其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。該藥物特定地作用于線蟲特有的煙堿乙酰膽堿受體亞科ACR-23蛋白，具有快速、高效和滲透性神經(jīng)肌肉效應(yīng)，通過引起體壁肌肉過度收縮導(dǎo)致咽前部麻痹、痙攣性收縮并最終死亡，可以有效殺滅耐受其他類別藥物的線蟲。國外已有大量研究表明該藥具有較好的驅(qū)蟲效果，同時(shí)還制定莫奈太爾的最大殘留限量[11-29]。歐盟37/2010規(guī)定：莫奈太爾在牛、羊乳中的最大殘留限量為0.17 mg/kg[30]。我國尚未制定出莫奈太爾的最大殘留限量。

圖1 莫奈太爾及其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of monepantel and its metabolites

目前，國外已有關(guān)于動(dòng)物組織中的莫奈太爾和莫奈太爾砜的相關(guān)報(bào)道[31]，乳制品中莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。因此，為保障食品安全，尤其是孕婦和嬰幼兒等敏感群體的健康，建立快速準(zhǔn)確測(cè)定乳制品中的莫奈太爾及其代謝物殘留量的檢測(cè)方法已迫在眉睫。本方法采用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜結(jié)合液液萃取凈化等技術(shù)，建立乳制品中莫奈太爾及其代謝物的檢測(cè)方法；采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校正定量結(jié)果，以減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度的影響。該方法操作簡(jiǎn)便、前處理成本低、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、定性定量準(zhǔn)確，能夠?yàn)榕Ｈ楹腿榉鄣热橹破分心翁珷柤捌浯x物莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜的分布狀況的監(jiān)測(cè)工作提供技術(shù)支持，為我國建立莫奈太爾的最大殘留限量提供數(shù)據(jù)支持與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳、乳粉 廣州市購。

莫奈太爾、莫奈太爾亞砜、莫奈太爾砜 美國Witega公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Tedia公司；乙酸銨（優(yōu)級(jí)純） 印度Fluka公司；去離子水由Millipore公司超純水機(jī)制得；中性氧化鋁固相萃取柱（1 g/3 mL） 美國色譜科公司，用3 mL乙腈活化，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

UFLC LC-20A超高效液相色譜儀 日本島津公司；4000 QTRAP三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）離子源） 美國AB Sciex公司；吹氮濃縮儀 美國Zymark Turbovap.LV公司；渦旋振蕩器 德國IKA公司；3-16K型高速離心機(jī)德國Sigma公司；超純水機(jī) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取適量莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，－18 ℃冰箱保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 mg/L）：分別吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：準(zhǔn)確吸取一定量的10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲醇逐級(jí)稀釋配制成100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用基質(zhì)空白溶液配制成0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

定容液：量取90 mL甲醇和10 mL 0.5 mmol/L乙酸銨溶液，搖勻備用。

1.3.2 樣品處理與凈化

稱取乳粉0.5 g（精確至0.01 g）至50 mL的離心管A中，加入2 mL水渦旋振蕩至溶解樣品完全（牛乳試樣2 g），加入5 mL飽和氯化鈉，渦旋振蕩2 min，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩10 min，超聲10 min，提取液以4 000 r/min離心5 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管B中。離心管A中加入8 mL乙腈重復(fù)提取一次，4 000 r/min離心5 min，上清液合并至離心管B中，用乙腈定容至20 mL刻度，搖勻。吸取8 mL（牛乳2 mL）樣品提取液50 ℃吹氮濃縮至干。殘?jiān)枚ㄈ菀喝芙獠⒍ㄈ葜?.0 mL，渦旋振蕩1 min，超聲5 min。加入5 mL正己烷渦旋振蕩0.5 min，3 000 r/min離心5 min，棄去上層溶液，再用正己烷重復(fù)脫脂一次，下層溶液50 ℃吹氮濃縮至干。殘?jiān)枚ㄈ菀喝芙獠⒍ㄈ葜?.0 mL，渦旋振蕩1 min，超聲5 min，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3.3 高效液相色譜條件

色譜柱：Inertsil C8（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流動(dòng)相：A甲醇+B 0.5 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫：0～3 min、10%～95% A，3～5 min、95% A，5～5.1 min、95%～10% A，5.1～10 min、10% A；流速0.30 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；掃描方式：負(fù)離子掃描；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）；氣簾氣壓力：173 kPa；霧化氣壓力：345 kPa；輔助加熱氣壓力：449 kPa；碰撞氣壓力：76 kPa；噴霧電壓：－4 500 V；離子源溫度：400 ℃；莫奈太爾及其代謝物的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 莫奈太爾及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric conditions for the analysis of monepantel and its metabolite standards

1.4 數(shù)據(jù)處理及圖像處理方法

數(shù)據(jù)及圖像處理軟件分別是Analyst 1.6.3以及JMP。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

莫奈太爾幾乎不溶于水，微溶于丙二醇和正辛醇，溶于乙醇，易溶于二氯甲烷和聚乙二醇[11]，本實(shí)驗(yàn)選取極性不等的3 種溶劑二氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯提取時(shí)容易發(fā)生乳化，且提取效率最低；二氯甲烷次之；乙腈的提取效率最高，牛乳樣品中3 種藥物的回收率在85.5%～100.2%之間，乳粉樣品中的提取效率稍低，為65.7%～80.3%。究其原因，乙腈加入乳粉樣品后，蛋白沉淀迅速，待測(cè)物質(zhì)被沉淀的蛋白包裹成團(tuán)，乙腈提取難以浸潤(rùn)到基質(zhì)內(nèi)部，降低了提取效率。因此，本實(shí)驗(yàn)著重考察乳粉樣品的提取實(shí)驗(yàn)，選取稱樣量為0.5、1.0 g和2.0 g乳粉樣品進(jìn)行提取，分別加入2 mL水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 mL水能夠?qū)?.5 g乳粉溶解完全；1.0 g乳粉未能溶解完全，再加入2 mL水渦旋振蕩后能夠溶解完全；稱樣量為2.0 g的乳粉，加水后結(jié)塊嚴(yán)重，需要繼續(xù)增加水的體積才能溶解完全。鑒于乳粉是采用噴霧干燥后一次成粉的生產(chǎn)工藝，不存在不均勻的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)減少實(shí)驗(yàn)中提取溶劑的用量，本實(shí)驗(yàn)最終選擇乳粉的稱樣量為0.5 g進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加入2 mL水將樣品溶解完全，再加入飽和氯化鈉，不但起到分散的作用，還能沉淀部分蛋白，最后再用乙腈提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳粉樣品中各藥物的提取效率在79.5～92.9%之間；同樣，牛乳樣品加入飽和氯化鈉，再用乙腈提取也得到很好的回收率效果，回收率為97.0%～102.9%。綜合考慮各因素，本實(shí)驗(yàn)選擇水-飽和氯化鈉-乙腈作為液態(tài)乳和乳粉的提取溶劑。

2.2 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)在相同的色譜分離條件下分別考察Inertsil C8柱、Atlantis Hillic柱和Atlantis T3柱。結(jié)果顯示：采用Atlantis Hillic柱進(jìn)行分離時(shí)，莫奈太爾及其代謝物在1.8 min處完成分離，峰形嚴(yán)重拖尾且開叉，峰寬0.8 min。采用Atlantis T3柱進(jìn)行分離時(shí)，莫奈太爾及其代謝物在8 min處開始分離，峰形較差，峰寬0.4～0.6 min。而在Inertsil C8柱上獲得了理想的分離效果，峰形尖銳對(duì)稱，峰寬0.25 min。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Inertsil C8柱。

2.3 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的組成與色譜柱及被分離的組分有關(guān)，流動(dòng)相的洗脫能力由其極性決定，強(qiáng)極性的流動(dòng)相占據(jù)吸附中心的能力強(qiáng)，其洗脫能力強(qiáng)，使組分的k值小，保留時(shí)間短[32]。對(duì)于電噴霧質(zhì)譜的負(fù)離子模式，流動(dòng)相只能選擇pH值較高的具有可揮發(fā)性的鹽類或者水。本實(shí)驗(yàn)考察甲醇、乙腈和水、不同濃度的乙酸銨溶液進(jìn)行多種組合，研究發(fā)現(xiàn)，采用甲醇作為有機(jī)相時(shí)莫奈太爾及其代謝物的靈敏度優(yōu)于乙腈；當(dāng)水相乙酸銨濃度高于0.5 mmol/L時(shí)，莫奈太爾及其代謝物靈敏度下降。另外還考察甲醇-水體系和甲醇-0.5 mmol/L乙酸銨體系的色譜分離情況：采用甲醇-0.5 mmol/L乙酸銨體系進(jìn)行分離時(shí)莫奈太爾和莫奈太爾亞砜的靈敏度比甲醇-水體系增強(qiáng)了18%和16%，莫奈太爾砜則沒有明顯變化。綜合考慮分離度、保留時(shí)間和色譜峰形等因素，本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇-0.5 mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相，分離結(jié)果見圖2。

圖2 莫奈太爾及其代謝物MRM色譜圖Fig. 2 Chromatograms of monepantel and its metabolite standard solution in MRM mode

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖3 莫奈太爾及其代謝物的二級(jí)離子碎片掃描質(zhì)譜圖Fig. 3 Tandem mass spectra of monepantel and its metabolite

用蠕動(dòng)泵以10 μL/min的流速分別連續(xù)注射0.5 mg/L的莫奈太爾及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液入ESI離子源中，在負(fù)離子檢測(cè)模式下對(duì)莫奈太爾及其代謝物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到莫奈太爾及其代謝物準(zhǔn)分子離子峰：莫奈太爾準(zhǔn)分子離子峰（m/z472）、莫奈太爾亞砜準(zhǔn)分子離子峰（m/z488）和莫奈太爾砜準(zhǔn)分子離子峰（m/z504）。分別對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到碎片離子信息，莫奈太爾的特征碎片離子分別為m/z186和m/z166，莫奈太爾亞砜的特征碎片離子分別為m/z186和m/z166，莫奈太爾砜的特征碎片離子分別為m/z186和m/z166，最終選擇響應(yīng)高、基線噪音低的離子對(duì)m/z472/186、m/z488/186和m/z504/186為定量離子對(duì)。莫奈太爾及其代謝物的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3。

2.5 線性范圍和定量限測(cè)定結(jié)果

在1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)條件下，取一系列不同質(zhì)量濃度的莫奈太爾及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/L），以莫奈太爾及其代謝物響應(yīng)峰面積（y）對(duì)莫奈太爾及其代謝物的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，分別比較莫奈太爾及其代謝物在0～20、0～10、0～5.0 μg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定值與實(shí)際值的比值（以0.2 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液為例）。結(jié)果表明，莫奈太爾及其代謝物在這3 個(gè)線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，但是標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 μg/L的測(cè)定值與實(shí)際值的比值分別為52.0%～64.5%、85.5%～86.0%和93.0%～99.5%，因此當(dāng)莫奈太爾及其代謝物的線性范圍為0～20 μg/L和0～10 μg/L時(shí)，樣品前處理后上機(jī)溶液質(zhì)量濃度接近0.2 μg/L時(shí)，測(cè)定值偏低，容易造成結(jié)果不準(zhǔn)確，采用0～5.0 μg/L的線性范圍進(jìn)行定量時(shí)，測(cè)定值接近實(shí)際值，定量更為準(zhǔn)確，故莫奈太爾及其代謝物采用0～5.0 μg/L的線性范圍，詳見表2。

表2 莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物線性方程Table 2 Calibration equations for monepantel and its metabolites in milk and milk powder

本實(shí)驗(yàn)選擇空白的乳制品樣品，當(dāng)添加量為2.0 μg/kg時(shí)，信噪比大于10，表明其定量限可達(dá)到2.0 μg/kg，空白樣品及加標(biāo)定量限樣品總離子流圖見圖4。當(dāng)樣品中的莫奈太爾及其代謝物含量超過此線性范圍時(shí)，可適當(dāng)加大樣品的稀釋倍數(shù)。

2.6 方法的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選用未含有莫奈太爾及其代謝物的牛乳和乳粉樣品分別進(jìn)行添加回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，添加量為2.0、4.0、20 μg/kg，按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行提取和凈化，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。3 個(gè)添加水平的平均回收率在79.5%～102.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～5.3%。表明本方法回收率穩(wěn)定，可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。

3 乳制品中莫奈太爾及其代謝物的加標(biāo)回收率與精密度（ =6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) for monepantel and its metabolite in dairy products ( = 6)

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

按照本研究所建立的方法對(duì)目前市場(chǎng)銷售的18 份牛乳和15 份乳粉樣品進(jìn)行測(cè)定，均未檢出莫奈太爾及其代謝物莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜。

3 結(jié) 論

本研究建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定乳制品中的莫奈太爾及其代謝物莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜的方法。結(jié)果表明，各組分的加標(biāo)回收率為79.5%～102.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～5.3%。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠、成本低，應(yīng)用于牛乳和乳粉等乳制品中莫奈太爾及其代謝物的檢測(cè)，可以得到滿意的結(jié)果。