左文怡，朱 莉，楊澤林，詹曉北*

（1 江南大學生物工程學院/糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122；2 無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇無錫 214125）

黃原膠(XG)是一種微生物大規(guī)模發(fā)酵產生的較廉價的多糖材料，其作為醫(yī)藥緩釋基質的作用已經有了不少研究報道。Andreopoulos等[1]研究了醫(yī)用水楊酸在單純黃原膠基質中的緩釋機制，發(fā)現(xiàn)藥物遞送過程在浸漬后的前10小時內完成，并且水楊酸通過非Fickian運輸釋放。Deb等[2]對黃原膠和Eudragit E100(一種丙烯酸樹脂)的聚電解質復合物基緩釋片進行了體內外評估，確定了片劑呈持續(xù)釋放狀態(tài)。Rutz等[3]使用復合凝聚法將殼聚糖/黃原膠微膠囊化然后進行霧化和凍干，得到了效果很好的類胡蘿卜素釋放載體。Shalviri等[4]用不同量的黃原膠和三偏磷酸鈉(STMP)合成淀粉交聯(lián)黃原膠聚合物，確定了這種淀粉交聯(lián)黃原膠水凝膠可以用作控釋制劑中的成膜材料。黃原膠在藥物釋放上的廣泛應用證明了它用作包埋劑有緩釋的效果，但其親水性使緩釋效果不能長久，因此在農用緩釋系統(tǒng)方面應用的相關研究較少，對黃原膠進行改性或接枝共聚后得到新型的水凝膠再對其緩釋等性能進行檢驗的研究則有不少。如Sukriti等[5]制備了基于黃原膠與聚丙烯酸接枝共聚物的生物降解水凝膠，并證明了這種水凝膠具有殺菌和控制農藥釋放的作用。魏釗華[6]研究了黃原膠與葡甘聚糖的復配體系，優(yōu)化后的復配體系可以用于緩釋部分藥物以及尿素等物質。Bueno等[7]將黃原膠與檸檬酸酯化交聯(lián)，獲得的凝膠可以用于開發(fā)pH控制的藥物傳遞系統(tǒng)。

還有一些對其他多糖進行改性，并研究了改性產物的溶脹與釋放行為。Bajpai等[8]以N, N-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑將羧甲基纖維素和聚丙烯酰胺接枝得到了一種水凝膠，研究了交聯(lián)劑用量、引發(fā)劑用量、pH值等條件對凝膠溶脹的影響。Jamnongkan等[9]以戊二醛為交聯(lián)劑制作了聚乙烯醇(PVA)/殼聚糖(CS)水凝膠，研究了PVA/CS水凝膠的溶脹性、保水性及其對復合無機肥的釋放行為的影響。Li等[10]以PVA水溶液為粘合劑制作了小麥纖維素接枝聚丙烯酸水凝膠，研究了粒徑、pH、鹽離子對凝膠的溶脹和肥料釋放能力的影響。另有一些學者的研究也表明，PVA水溶液是一種很好的粘合劑[11-12]，并且在自然環(huán)境中可以生物降解[13]，對環(huán)境友好。

本研究以未改性的黃原膠作為主要基質，以植物生長調節(jié)劑水楊酸(SA)為釋放的模式物質，選用PVA溶液為粘合劑，將粉末狀的黃原膠與水楊酸粘合造粒，通過混合少量其他物質以期獲得更長的釋放持續(xù)時間，開發(fā)其應用于農用緩釋系統(tǒng)的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗材料孔徑為29.96 μm的食品級尼龍網布制成的束口尼龍袋(誠譽網業(yè))。試劑包括：黃原膠粉末(純度86.76%、水分9.23%、重均分子量2 × 107，由本試驗室提供)；醋酸酯淀粉(食品級，天和生物科技有限公司)；硬脂酸(AR級，國藥集團，研磨成粉)；殼聚糖(BR級，國藥集團，脫乙酰度80%～95%，粘度50～800 mPa·s)；水楊酸(AR級，國藥集團)；聚乙烯醇 (沃凱 AH-26，粘度 58.0～66.0 mPa·s，醇解度97.0～98.0 mole%，國藥集團)；無水乙醇(AR級，國藥集團)；去離子水。

1.2 試驗儀器

紫外分光光度計日立U-3900(日本日立株式會社)；電子分析天平TP-A300(福州華志科學儀器有限公司)；漩渦振蕩器QL-861(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；電熱鼓風干燥箱GZX-9070MBE(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；具塞玻璃層析柱(直徑 40 mm × 高 300 mm)；手動制丸板 (網銷渠道)，燒杯等實驗室常用器具。

1.3 試驗方法

1.3.1 緩釋系統(tǒng)制作與試驗條件 配制4%、5%、6%(w/v)三種濃度的PVA水溶液：各稱取4、5、6 g的PVA固體，分別加入100 mL去離子水中，在沸水浴下攪拌至溶解為澄清粘稠液體。

將各材料按設計的比例研磨混勻后，以PVA溶液為粘合劑將其粘合造粒，顆粒直徑6～10 mm，稱量未烘干前總重量(W0)后將顆粒在60℃下烘干24 h后再稱量烘干后總重量(W1)，裝入密封袋備用。

試驗在室溫10～15℃條件下進行。

1.3.2 緩釋顆粒中水楊酸含量理論值的計算公式

1)緩釋顆粒的烘干失水率(WL)：

式中：W1代表烘干后顆?？傊兀籛0代表烘干前顆?？傊亍８鶕?jù)試驗統(tǒng)計、計算，所有配方制成的緩釋顆粒烘干后的失水率均在40%～50%之間，為方便算出每個緩釋顆粒中水楊酸含量的理論值，統(tǒng)一將失水率定為45%。

2)單個緩釋顆粒中水楊酸含量的理論值(S)：

式中：W代表單個緩釋顆粒實際稱重重量；WL為緩釋顆粒烘干失水率；P代表根據(jù)設計的配方計算得來的水楊酸占比。

1.3.3 水楊酸含量的測定 采用紫外分光光度計法測量溶液中水楊酸含量，參考鄧冬莉等[14]的方法，并進行改進。

1)標準溶液的制備：精密稱取水楊酸對照品0.1 g，置100 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得1 mg/mL水楊酸儲備液。

2)標準曲線的繪制：精密吸取水楊酸儲備液0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2 mL 分別置50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，以60%乙醇為參比在300 nm處測其吸光度，以水楊酸含量為橫坐標、吸光度OD300為縱坐標，繪制標準曲線并擬合得到回歸方程。

水楊酸含量在5～40 μg/mL范圍內線性良好。

3)回收率試驗：精密吸取水楊酸儲備液0.6、1.2、1.8 mL，置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，在300 nm處測其吸光度；再將稀釋后的理論濃度代入 (2) 式回歸方程中計算出理論OD300值。實測OD300值與理論OD300值的比值為水楊酸的回收率。

經過測量、計算，三個樣品的回收率分別為100.67%、102.98%、99.83%，在誤差接受范圍內。

4)樣品測定：取1 mL待測樣品溶液，加入1.5 mL無水乙醇使其乙醇濃度為60%，在300 nm處測其吸光度，代入回歸方程得濃度后乘以相應稀釋倍數(shù)。

1.3.4 水中溶出率法釋放曲線的測定[12]緩釋顆粒稱重后，根據(jù)公式計算其所含水楊酸量的理論值(S)，放入束口尼龍袋并放入500 mL燒杯中。在500 mL燒杯中加入200 mL水浸沒尼龍袋，每隔6小時將尼龍袋取出，收集濾液，測量體積及水楊酸含量后倒掉 ，加入新的200 mL水繼續(xù)浸泡，水楊酸累積釋放量增長變緩時延長測量間隔，重復浸泡至釋放量增長無法檢出。以浸泡時間為橫坐標，以累積的水楊酸釋放量占理論值的百分比(以下簡稱水楊酸釋放率)為縱坐標，繪制水楊酸釋放率隨浸泡時間變化曲線。

1.3.5 土柱淋溶法釋放曲線的測定[11-12]淋溶裝置如圖1所示。在具有活塞的玻璃層析柱內先放一團脫脂棉花，加入200 g河砂，以100 mL左右水使土柱完全潤濕(打開活塞至底端不再滴水)，然后在上面放置2顆緩釋顆粒與20 g河砂的混合物，隨即再于混合物上覆蓋100 g河砂，輕晃砂柱使砂面平整，在最上層覆蓋一層與底面相同的脫脂棉花，再以20 mL左右的水使上層土柱潤濕。每隔1天用50 mL水潤洗，收集濾液，測量濾液體積并取1 mL樣測水楊酸含量。以浸泡時間為橫坐標，水楊酸累積釋放量為縱坐標，繪制水楊酸累積釋放總量隨浸泡時間變化曲線。

圖 1 土柱淋溶裝置圖Fig. 1 Device diagram of soil column leaching

2 結果與分析

2.1 靜水浸出試驗下的條件優(yōu)化

2.1.1 黃原膠粒徑的選擇 選擇0.178 mm、0.074 mm兩種不同粒徑的黃原膠粉末，控制其余變量一致，XG∶SA(w/w) = 2∶1，造粒直徑D = 7 mm，使用5% PVA溶液進行造粒，(XG+SA) ∶5% PVA(w/w) = 1∶1。圖2表明，0.178 mm粒徑的黃原膠所制成的緩釋顆粒2天左右水楊酸釋放率大于80%，在2 天后基本不再上升；而0.074 mm粒徑的黃原膠制成的緩釋顆粒在1 天左右水楊酸釋放率就超過80%且?guī)缀醪辉偕仙?。由此說明，0.178 mm粒徑的黃原膠制備的顆粒緩釋效果優(yōu)于0.074 mm粒徑的黃原膠，因此，選定0.178 mm粒徑的黃原膠繼續(xù)進行試驗。

圖 2 不同粒徑黃原膠制備的緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時間的釋放率Fig. 2 Release percentage of SA in slow-release granules prepared from different sizes of xanthan gum with soaking time

2.1.2 造粒條件的確定

2.1.2.1 造粒直徑的優(yōu)化 圖3a表明，不同造粒直徑的條件下，水楊酸釋放率在0～36 h上升都很快，36 h之后則有不同程度的減緩。在XG∶SA =8∶1，使用5% PVA溶液粘合造粒時，隨著造粒直徑的增大，所制得的緩釋顆粒對SA的釋放持續(xù)時間呈現(xiàn)先增長后減少的規(guī)律，8 mm直徑時的釋放持續(xù)時間最長，在2 天左右。

圖 3 不同造粒直徑和粘合劑濃度下緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時間的釋放率Fig. 3 Release percentage of SA in prepared slow-release granules under different granule sizes and adhesive concentrations with soaking time

2.1.2.2 粘合劑濃度的優(yōu)化 如圖3b所示，確定造粒直徑為8 mm后，在XG∶SA = 2∶1的條件下比較了不同濃度的PVA溶液對SA釋放的影響。其中以4% PVA溶液造粒(混合粉末與4% PVA溶液重量比為1.1∶1)所得的顆粒釋放持續(xù)最長，在2.5 天左右，高峰在前1.5 天。

因此，最終確定的造粒條件為：造粒直徑8 mm，以4% PVA溶液為粘合劑進行造粒。

2.1.3 配方優(yōu)化

2.1.3.1 黃原膠 + 聚乙烯醇 + 水楊酸配方 用7種XG∶SA比例制成的緩釋顆粒(造粒直徑D = 8 mm，粘合劑4% PVA溶液)中，水楊酸隨浸泡時間的釋放率變化曲線如圖4所示。隨著黃原膠XG比例的加大，水楊酸隨浸泡時間的延長釋放率在下降；釋放持續(xù)時間在3∶1之后則是隨黃原膠比例增大而減少縮短。表現(xiàn)最佳的比例是3∶1，前1.5 天是釋放高峰期，2.5 天左右后釋放量基本不再增長。

2.1.3.2 黃原膠 + 聚乙烯醇 + 醋酸酯淀粉 + 水楊酸配方 醋酸酯淀粉（AS）是一種黏度高，澄明度高，凝沉性弱，儲存穩(wěn)定的疏水性淀粉。將造粒直徑固定在8 mm，使用4%PVA溶液粘合造粒。由圖5可以看出，隨著醋酸酯淀粉加入的比例增加，最終水楊酸釋放率先上升后下降，最高的是XG∶AS∶SA = 3∶1∶1。各比例對釋放持續(xù)時間的影響差異不明顯，釋放持續(xù)約2.5 天。

圖 4 含不同XG∶SA比例的緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時間的釋放率(D=8 mm, 4% PVA)Fig. 4 Release percentage of SA in prepared slow-release granules containing different XG∶SA ratio with soaking time ( D=8 mm, 4% PVA)

圖 5 含不同XG∶AS∶SA比例的緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時間的釋放率(D=8 mm, 4% PVA)Fig. 5 Release percentage of SA in prepared slow-release granules containing different XG∶AS∶SA ratio with soaking time (D=8 mm, 4% PVA)

2.1.3.3 黃原膠 + 聚乙烯醇 + 硬脂酸 + 水楊酸配方將造粒直徑固定在8 mm，使用4%PVA溶液粘合造粒，分別制作XG∶硬脂酸∶SA比例為1∶1∶1、2∶1.5∶1、3∶0.5∶1、2∶2∶1、3∶1∶1 的緩釋顆粒，緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時間的釋放率變化如圖6所示。從圖中可以看出，隨著硬脂酸加入比例的上升，釋放持續(xù)的時間先增長后減短，轉折點在XG∶硬脂酸∶SA比例為1∶1∶1的顆粒，該配方制成的緩釋顆粒對SA的釋放時間可以持續(xù)約3 天。最終水楊酸釋放率隨著硬脂酸加入比例的上升呈現(xiàn)下降的趨勢。對水楊酸含量相同、黃原膠和硬脂酸含量不一樣的配方的釋放行為進行對比可以發(fā)現(xiàn)，硬脂酸含量越多，水楊酸釋放受到的抑制越強，有利于在更長時間內實現(xiàn)緩釋。綜合來看，XG∶硬脂酸∶SA = 1∶1∶1，D = 8 mm，4%PVA造粒時緩釋效果最好，可持續(xù)約3 天。

圖 6 含不同XG∶硬脂酸∶SA比例的緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時間的釋放率(D=8 mm, 4% PVA)Fig. 6 Release percentage of SA in prepared slow-release granules containing different XG: stearic acid∶SA ratio with soaking time (D=8 mm, 4% PVA)

2.1.3.4 黃原膠 + 聚乙烯醇 + 殼聚糖(CS) + 水楊酸配方 不同XG∶CS∶SA比例所制成的緩釋顆粒中水楊酸的釋放率隨浸泡時間的變化曲線如圖7所示。以外形觀察結果來看，只有殼聚糖加入最少的XG∶CS∶SA = 3∶0.5∶1配方有較明顯的溶脹行為，且較早釋放結束，其他配方則一直保持丸狀的基本形狀，釋放也較慢。隨著殼聚糖加入比例的上升，釋放持續(xù)時間逐漸延長，XG∶CS∶SA = 1∶1∶1和2∶1.5∶1(殼聚糖含量相同)時最遲，但由于殼聚糖成本較高，綜合考慮還是選擇XG∶CS∶SA =3∶1∶1的配比，所制成的緩釋顆粒釋放時間可以持續(xù)約4 天。

圖 7 含不同XG∶CS∶SA比例的緩釋顆粒中水楊酸隨浸泡時間的釋放率(D=8 mm, 4% PVA)Fig. 7 Release percentage of SA in prepared slow-release granules containing different XG∶CS∶SA ratio with soaking time (D=8 mm, 4% PVA)

2.2 優(yōu)化配方的土柱淋溶試驗

試驗方法同前文。選取優(yōu)化所得的配方(XG∶CS∶SA = 3∶1∶1，D = 8 mm，4% PVA)所制成的緩釋顆粒進行土柱淋溶試驗，釋放曲線如圖8所示，持續(xù)了約36 天。

同樣配方的緩釋顆粒在土中的釋放比在水中慢很多，這是因為在土中顆粒不會一直保持被水浸泡的狀態(tài)，得以緩慢地釋放內容物，其結果比靜水浸出試驗更具參考價值。

3 討論

根據(jù)靜水浸出試驗結果分析，粗粒徑的黃原膠溶解更緩慢，對內容物的釋放也會更慢。緩釋顆粒直徑較小時最終釋放的百分比更高但由于比表面積大釋放也更快，顆粒過大時最終釋放的百分比會降低且持續(xù)時間也不會延長。

圖 8 土柱淋溶法測量的緩釋顆粒中SA的累計釋放量隨掩埋時間的變化Fig. 8 Cumulative release of SA with buried time measured with soil column leaching method

根據(jù)土柱淋溶試驗結果，醋酸酯淀粉作為無毒無害可降解的疏水性材料，其加入使制成的緩釋顆粒在水中的釋放持續(xù)效果比XG + PVA + SA配方延長了2 天左右，且醋酸酯淀粉本身較廉價，也有相關研究證實其緩釋作用[15-16]，配方較為可行。

加入硬脂酸制成的緩釋顆粒的釋放持續(xù)時間相比加入醋酸酯淀粉的配方延長約3 天，但硬脂酸的自然降解很少有文獻涉及，僅有一篇在自然環(huán)境中篩選出硬脂酸降解菌的相關文獻[17]，因此硬脂酸雖然無毒且在醫(yī)藥片劑中有所應用[18-19]，但在土壤中難以降解，該配方并不理想。

殼聚糖在緩釋材料方面的應用早有研究[9]，且殼聚糖具有吸附土壤中重金屬、凈化水質、促進植物生長、誘導植物抗病性、改善土壤團粒結構等作用[20-24]，因此在配方中加入殼聚糖對土壤、水環(huán)境無害。且殼聚糖(CS)在溶液環(huán)境中分子帶有正電荷，與分子帶負電荷的黃原膠和水楊酸混勻，可以以電荷的吸引作用來延長釋放效果，試驗結果也顯示這個方向有一定效果。在加入殼聚糖的配方制成的緩釋顆粒中，雖然殼聚糖比例越高緩釋顆粒的釋放持續(xù)時間會越長，但當殼聚糖使用過多時持續(xù)時間的延長效果相較于成本的提升并不理想，綜合考慮成本和緩釋效果，選擇XG∶CS∶SA = 3∶1∶1，D= 8 mm，4%PVA造粒的配方較好，在水中持續(xù)時間約4 天，高峰期在前2.5 天，在土柱中則可以達到36 天，是本試驗設計的配方所制成的緩釋顆粒中釋放持續(xù)時間最久的。該配方制成的緩釋顆粒在土柱中的緩釋效果較接近本研究的預期效果，還需進一步研究pH值、鹽離子環(huán)境、溫度等條件對緩釋顆粒的釋放行為造成的影響。

4 結論

經過優(yōu)化，以黃原膠為主要基質的緩釋顆粒中，水楊酸的釋放在前60 h快速增長，60～80 h為轉折點，之后趨于平緩。優(yōu)化配方為黃原膠∶殼聚糖∶水楊酸質量比例為3∶1∶1，造粒直徑8 mm，以4% PVA溶液進行粘合造粒，混合粉末與粘合劑重量比為1.1∶1，所得的緩釋顆粒在去離子水中釋放時間可持續(xù)約4 天，高峰期在前2.5 天，在土柱中則可以持續(xù)36 天，較為成功。該體系使用材料成本較低、無污染、易操作，拓寬了黃原膠的應用范圍并提供了一種不需要復雜操作的緩釋系統(tǒng)制作方法。