孫 濤，張 園，朱長(zhǎng)軍

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 腫瘤防治研究所，烏魯木齊 830011）

結(jié)腸癌作為全球最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，患者死亡率在常見的惡性腫瘤患者死亡率中位居第2位[1]，在我國(guó)的年均發(fā)病率高達(dá)4%[2].近年來(lái)，結(jié)腸癌患者數(shù)量不斷增加，年齡逐漸趨向年輕化，且男性發(fā)病率大于女性[3].目前，對(duì)結(jié)腸癌早期診斷的水平仍較低，如傳統(tǒng)的免疫法糞便隱血試驗(yàn)、CT 仿真結(jié)腸鏡、膠囊結(jié)腸鏡等技術(shù)，均存在特異性差、假陽(yáng)性高、適用范圍狹窄等缺點(diǎn)[4-7].據(jù)統(tǒng)計(jì)，近1/3 患者確診時(shí)已處于結(jié)腸癌的進(jìn)展期或晚期.Shane 等[8]研究表明，早期結(jié)腸癌患者愈后5年生存率為80%，進(jìn)展期結(jié)腸癌患者愈后5年生存率僅為50%.因此選擇適當(dāng)?shù)脑缙谀[瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢查，提高早期結(jié)腸癌診斷率，成為延長(zhǎng)結(jié)腸癌患者生存率的重要手段[9].

細(xì)胞基因組穩(wěn)定性對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)增殖至關(guān)重要.如果細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)生DNA 損傷又不能及時(shí)修復(fù)，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞走向死亡或引起基因組不穩(wěn)定，最終誘發(fā)腫瘤.細(xì)胞為保護(hù)基因組的穩(wěn)定性不被DNA 損傷所破壞，進(jìn)化出了精密的DNA 損傷修復(fù)機(jī)制.其中，對(duì)于DNA 雙鏈損傷（DSBs）的修復(fù)主要由末端連接（NHEJ）和同源重組修復(fù)（HR）2 個(gè)途徑完成.NHEJ 途徑貫穿整個(gè)細(xì)胞周期，HR 卻只出現(xiàn)在S/G2期[10].HR 途徑能確保DSBs 處修復(fù)后與原本序列一致，從而保證了基因組的完整性和穩(wěn)定性.因此，參與調(diào)控HR 途徑的關(guān)鍵蛋白既是目前DNA 損傷修復(fù)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，也是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要蛋白.p53 結(jié)合蛋白1（p53-binding protein 1，53BP1）是HR 途徑上的一個(gè)成員，DNA 發(fā)生雙鏈斷裂損傷時(shí)，磷酸化修飾后的53BP1 如果聚集到DSBs 處，會(huì)阻止HR 的進(jìn)行[11-13].53BP1的高表達(dá)或功能異常往往會(huì)造成細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，引起腫瘤的發(fā)生.

為了深入研究53BP1 蛋白分子與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，本課題組嘗試了幾種市場(chǎng)化的抗53BP1 蛋白抗體，細(xì)胞水平的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這些抗體均不能滿足實(shí)驗(yàn)需要.為此，本研究設(shè)計(jì)了53BP1蛋白分子的抗原多肽并將其應(yīng)用于特異性抗53BP1多克隆抗體的制備.應(yīng)用該抗體對(duì)31例結(jié)腸癌組織及其癌旁組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，結(jié)合臨床病例資料分析和ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，探究53BP1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況.本研究結(jié)果將為53BP1 應(yīng)用于結(jié)腸癌的早期診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS、人子宮頸癌細(xì)胞株Hela 均為本實(shí)驗(yàn)室自存.

1.1.2 試劑

蛋白預(yù)染Marker，日本Takara 公司；胎牛血清、胰蛋白酶，美國(guó)GIBCO 公司；HRP 標(biāo)記的二抗，美國(guó)Invitrogen 公司；細(xì)胞完全培養(yǎng)基DMEM，北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司；免疫組化試劑盒，美國(guó)BOSTER公司；結(jié)腸癌組織芯片，武漢谷歌生物科技有限公司（芯片編號(hào)：DZX2017.9）；Protein A 耦聯(lián)的瓊脂糖凝膠柱，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗53BP1抗體的抗原多肽CIEDSQPESQVLEDD（根據(jù)53BP1 蛋白分子一級(jí)結(jié)構(gòu)中的第21 位至第35 位氨基酸設(shè)計(jì)制備），由武漢丹港生物科技有限公司合成.

1.1.3 儀器

蛋白電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；Nikon TS-100 FL倒置熒光顯微鏡和Nikon 90i 共聚焦熒光顯微鏡，日本Nikon 公司.

1.2 方法

1.2.1 抗體制備

設(shè)計(jì)合成抗原多肽CIEDSQPESQVLEDD 并將其偶聯(lián)到載體血藍(lán)蛋白（KLH）上，與抗體佐劑以1 ∶1 的體積比混勻，皮下注射入新西蘭大白兔背部.第一次注射抗原多肽前，耳緣靜脈取血作為免疫前血清.每次注射抗原多肽一周后，耳緣靜脈取血制備血清并進(jìn)行血清驗(yàn)證，一直持續(xù)3～5 個(gè)月.血清驗(yàn)證得到高滴度的特異性抗53BP1 抗體后，將兔子從股動(dòng)脈放血，得到終血清（約50 mL）.

1.2.2 抗體血清驗(yàn)證

將長(zhǎng)滿10 cm2平皿的U2-OS 細(xì)胞（約8.8×107）置于冰上，吸去培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，加1 mL 的PBS并用干凈的細(xì)胞刮沿同一方向?qū)⒓?xì)胞收集到1.5 mL離心管中.在4 ℃、1 000 r/min 條件下，離心3 min，吸去PBS.用880 μL 的RIPA 裂解液將細(xì)胞沉淀吹吸均勻，置于冰上1 h.將細(xì)胞裂解液于4 ℃、14 000 r/min 條件下離心30 min，取上清液200 μL 并加入1 μL 血清，4 ℃下孵育過(guò)夜.次日取20 μL 的Protein A beads與細(xì)胞裂解液在4 ℃條件下繼續(xù)孵育2 h.隨后在4 ℃、1 000 r/min 條件下離心3 min，并用RIPA 裂解液洗3次.之后取沉淀，加入20 μL 的2×loading buffer，95 ℃下煮樣5 min，4 ℃、14 000 r/min 條件下離心2 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE 和Western blot 檢測(cè).

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光染色

用體積分?jǐn)?shù)為3%的福爾馬林和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的蔗糖的PBS 溶液在室溫下處理細(xì)胞15 min，PBS 洗3 次后用濃度為0.1 mol/L 甘氨酸的PBS 溶液浸泡細(xì)胞5 min.用體積分?jǐn)?shù)為10%的血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的Triton X-100 的PBS 溶液封閉細(xì)胞30 min.二抗為FITC 或Texas Red 標(biāo)記的羊源二抗，采用DAPI 染色DNA.一抗（53BP1 抗血清）室溫孵育2 h，二抗室溫避光孵育1 h，DAPI 室溫避光孵育3 min.

1.2.4 免疫組化染色檢測(cè)

應(yīng)用通用型免疫組化試劑盒進(jìn)行組織標(biāo)本免疫組化染色實(shí)驗(yàn).首先對(duì)組織芯片進(jìn)行脫蠟處理，然后進(jìn)行抗原修復(fù)，接著用山羊血清對(duì)組織芯片進(jìn)行封閉處理30min.倒干液體，加入適量53BP1 抗血清（與PBST 按照體積比1 ∶500 稀釋）于組織切片上，室溫孵育1 h.PBS洗3 次，每次2 min，加入HRP 偶聯(lián)的二抗（與PBST按照體積比1 ∶500 稀釋）室溫孵育20 min.PBS 洗3 次，每次2 min，加入DAB 顯色液.鏡下觀察染色情況，之后用水沖洗.對(duì)組織切片進(jìn)行梯度脫水，即將載玻片依次放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、二甲苯中，每種試劑中放置5 min，最后封片.

1.2.5 ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

登錄ONCOMINE網(wǎng)站，在搜索欄（search）輸入53BP1，限制搜索條件，檢索53BP1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá).

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)卡方檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 53BP1的抗血清驗(yàn)證

將化學(xué)合成的53BP1 抗原多肽與KLH 偶聯(lián)，對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行皮下注射.免疫5 次后抽血，離心之后可得到抗血清.收集U2-OS 細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該抗血清的特異性，結(jié)果如圖1 所示.由圖1 可以看出，在53BP1 抗血清IP 泳道和1/10 全細(xì)胞裂解液泳道約220×103處檢測(cè)到了條帶.

圖1 蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)53BP1 抗血清結(jié)合內(nèi)源53BP1 分子的鑒定Fig.1 Identification of endogenous 53BP1 protein molecules combined with 53BP1 antibody by immunoprecipitation experiment

通過(guò)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，對(duì)體外培養(yǎng)的HeLa 細(xì)胞進(jìn)行53BP1 和DNA 的染色，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖2 所示.由圖2 可以看出，與DNA 染色結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，53BP1 絕大部分定位在間期細(xì)胞的細(xì)胞核位置，少數(shù)游離于細(xì)胞核外.

圖2 53BP1 抗血清的細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定（10×）Fig.2 Appraisal 53BP1 antibody by immunofluorescence experiment（10×）

應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，用53BP1 抗血清和蘇木精分別對(duì)同一結(jié)腸癌組織的2 張切片進(jìn)行染色，結(jié)果如圖3 所示.比較53BP1 抗血清染色和蘇木精染色結(jié)果可以看出，53BP1 抗血清在結(jié)腸癌組織中的著色位置與蘇木精的著色位置基本一致，主要定位于組織中的細(xì)胞核.

圖3 53BP1 抗血清的免疫組織化學(xué)染色鑒定Fig.3 Appraisal 53BP1 antibody by immunohistochemical staining

以上結(jié)果表明，本研究制備的53BP1 抗血清具有特異性，可以應(yīng)用于臨床病理組織的免疫組織化學(xué)染色.

2.2 53BP1表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理因素的關(guān)系

應(yīng)用上述53BP1 抗血清對(duì)結(jié)腸癌組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果如圖4 所示.

圖4 53BP1 抗血清的免疫組織化學(xué)染色Fig.4 Immunohistochemical staining with 53BP1 antibody

通過(guò)對(duì)圖4 中組織著色深淺的分析，比較53BP1在31 個(gè)病例中癌組織和癌旁組織的表達(dá)，結(jié)果如圖5 所示.由圖5 可以看出，在結(jié)腸癌組織中，53BP1的表達(dá)量高于癌旁組織，通過(guò)無(wú)重復(fù)雙因素分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）.

圖5 53BP1 在結(jié)腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)Fig.5 Expression of 53BP1 in colorectal cancer and tissues adjacent to cancer

利用上述結(jié)腸癌組織芯片的53BP1 染色結(jié)果，分析它在不同TNM 分期的癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異，結(jié)果如圖6 所示.由圖6 可以看出，在所有結(jié)腸癌TNM 分期中，癌組織中的53BP1表達(dá)量均高于癌旁組織中的表達(dá)量，其中，Ⅱ期結(jié)腸癌患者癌組織與癌旁組織中表達(dá)量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）.Ⅰ期結(jié)腸癌組織中的53BP1 也呈現(xiàn)高表達(dá)，但癌組織與癌旁組織中的表達(dá)量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）.

圖6 53BP1 在不同TNM 分期的結(jié)腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)Fig.6 Expression of 53BP1 in colorectal cancer and tissues adjacent to cancer with different TNM stages

統(tǒng)計(jì)不同結(jié)腸癌臨床病理因素中53BP1的表達(dá)量，結(jié)果如表1 所示.由表1 可以看出，結(jié)腸癌組織中53BP1的高表達(dá)與腫瘤大小和TNM 分期密切相關(guān)：當(dāng)腫瘤組織≥4 cm 時(shí)，17 例結(jié)腸癌患者中有15例患者的53BP1 高表達(dá)，顯著高于腫瘤組織＜4 cm 患者的表達(dá)比例； 在TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期的結(jié)腸癌患者中，16 例患者中有14 例患者的53BP1 高表達(dá)，顯著高于Ⅲ-Ⅳ期患者的表達(dá)比例.53BP1的高表達(dá)與患者的年齡、性別、分級(jí)、腫瘤是否轉(zhuǎn)移等相關(guān)性不顯著.

表1 53BP1 蛋白分子與結(jié)腸癌臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 Relationship between 53BP1 and colorectal cancer tissue in clinical pathological features

2.3 基于ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)分析53BP1 在結(jié)腸癌中的表達(dá)

檢索ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)中53BP1在結(jié)腸癌中的表達(dá)，結(jié)果如圖7 所示.由圖7 可以看出，53BP1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織.

圖7 ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的53BP1 在結(jié)腸癌中的表達(dá)Fig.7 Expression of 53BP1 in colorectal cancer in the ONCOMINE database

3 討論與結(jié)論

53BP1 是DNA 雙鏈損傷（DSB）修復(fù)途徑中一個(gè)重要的蛋白分子，能在DSB 發(fā)生后第一時(shí)間被磷酸化且聚集在DNA 損傷處，被公認(rèn)為DNA 雙鏈損傷的標(biāo)志分子之一[14].若53BP1 功能異?；蛘弑磉_(dá)量升高，則會(huì)阻止DSB 修復(fù)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，使細(xì)胞發(fā)生死亡或者癌變.此外，53BP1 還具有其他生理功能，如調(diào)控細(xì)胞周期等[15].因此，該蛋白分子可作為一個(gè)重要的潛在分子標(biāo)志物，用于檢測(cè)腫瘤的發(fā)生發(fā)展.

本研究設(shè)計(jì)了53BP1 抗原多肽，通過(guò)免疫新西蘭大白兔制備抗53BP1 血清，將該抗血清應(yīng)用于免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)后，在220×103處檢測(cè)到條帶，說(shuō)明該抗血清能特異性結(jié)合53BP1 蛋白分子，輔以細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)的鑒定.將上述結(jié)果與其他研究對(duì)比后，確定了該抗體的特異性，證明該抗體可以應(yīng)用于結(jié)腸癌組織芯片的免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)[12-15].對(duì)結(jié)腸癌組織芯片的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行分析，并結(jié)合ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果得出，53BP1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且與結(jié)腸癌組織大小和TNM 分期有關(guān).在腫瘤組織≥4 cm 的病例中癌組織的53BP1表達(dá)量比癌旁組織高；同時(shí)，在結(jié)腸癌Ⅱ期中，癌組織的53BP1表達(dá)水平明顯高于癌旁組織.因此，53BP1 在早期結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng).當(dāng)腫瘤發(fā)展到Ⅱ期時(shí)，53BP1的高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)腫瘤向周圍組織浸潤(rùn).但當(dāng)結(jié)腸癌進(jìn)入Ⅲ期、Ⅳ期時(shí)，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和/或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，癌組織和癌旁組織中的53BP1表達(dá)無(wú)顯著差異，預(yù)示53BP1 可能與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移沒(méi)有相關(guān)性.本研究結(jié)果表明53BP1 是一個(gè)潛在的結(jié)腸癌早期分子標(biāo)志物，這些研究為53BP1 應(yīng)用于臨床結(jié)腸癌的早期診斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).