農(nóng)生斌 盧紅梅

(1.右江民族醫(yī)學院,廣西百色 533000;2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院,廣西南寧 530007)

白花鬼針草(Bidens Pilosa L.var.radiata)為菊科鬼針屬植物,具有清熱解毒、利濕退黃、散瘀活血的效用[1],我國民間上主要用于治療高血壓病、感冒發(fā)燒、中暑、消化不良、糖尿病等,還有用于治療跌打內(nèi)外傷、胃腸炎、急性黃疸型肝炎等疾病,研究表明,白花鬼針草乙醇乙酯提取物能顯著抗癌,抑制結腸癌RKO細胞的增殖及誘導其凋亡[2]。為探討白花鬼針草提取液對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用,為白花鬼針草進一步開發(fā)成為保肝護肝藥物提供理論依據(jù),筆者開展白花鬼針草提取液對小鼠急性酒精性肝損傷保護作用的研究,現(xiàn)報道如下。

1 材料與儀器

1.1 儀器

和試劑TDZ4A-WS型臺式低速離心機(上海安亭科學儀器廠);TGL-16G型臺式低速離心機(上海安亭科學儀器廠);PR0200型勻漿機(江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠)。G80D23CSL型微波爐;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、乙醇脫氫酶(ADH)及總超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(均購于南京建成生物工程研究所)。

1.2 藥品

白花鬼針草,經(jīng)右江民族醫(yī)學院民族醫(yī)學教研室覃道光副教授鑒定為真品;56°紅星二鍋頭;海王金樽片。

1.3 實驗動物

昆明種SPF級健康雄性小鼠,體重18～22g,許可證編號：SYXK桂2011～0010,由右江民族醫(yī)學院實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 白花鬼針草提取液的制備[5]

取適量白花鬼針草全草干品粉碎,按水料比4∶1浸泡40min,盛裝于1000ml玻璃燒杯中,加蓋微波處理5次,每次30s。微波處理后,用10倍的蒸餾水分2次浸提,每次30min,合并濾液,真空抽濾后濃縮約至每毫升白花鬼針草提取液含生藥1g,即1.0g/ml。冰箱冷藏備用。

2.2 小鼠最佳給酒量的篩選[6]

醉酒狀態(tài)的判斷以翻正反射是否消失為指標,小鼠灌酒后,將其背部向下輕放于平板上,若背向下的姿勢能夠保持30s以上則視為翻正反射消失,即為醉酒。取SPF級雄性小鼠50只,根據(jù)隨機數(shù)字表將小鼠隨機分為5組,每組10只小鼠,并以0.12ml/10g、0.13 ml/10g、0.14ml/10g、0.15ml/10g、0.16ml/10g的灌酒劑量隨機給5組貼上標簽,采用灌胃法給上述各組小鼠相應劑量的紅星56°二鍋頭酒,統(tǒng)計各組醉酒例數(shù)和死亡情況,選擇致小鼠急性酒精中毒模型所需的最佳給酒量。

2.3 小鼠的分組及給藥[7]

取SPF級雄性小鼠84只,體重18～22g,適應性飼養(yǎng)1周后,根據(jù)隨機數(shù)字表分成6個組,正常組、模型組、陽性組(海王金樽1g/ml)及白花鬼針草提取液低劑量、中劑量及高劑量組(分別為0.25g/ml、0.5g/ml及0.75g/ml),每組14只。各組小鼠均按0.1ml/10g的劑量灌胃給予相應藥液。除正常組和模型組給予等體積生理鹽水外,其余各組分別給予相應劑量藥液,每天1次,連續(xù)7d。末次給藥前禁食不禁水12h后灌胃給予藥液,30min后除正常組給予等體積生理鹽水外,其余各組均采用2.2.2中最佳給酒量一次性灌胃56°紅星二鍋頭酒。觀察小鼠醉酒潛伏期、醉酒率及死亡情況。

2.4 指標檢測

于給酒6h后,摘眼球取血,以2500r/min離心15min分離血清備用;小鼠脫臼處死,迅速剖取肝臟,稱取肝濕重,取適量肝組織制備10%的組織勻漿,以3500r/min離心15min后取上清液;嚴格按照試劑盒說明書檢測ALT、AST、ADH、SOD、GSH和MDA各項指標。

2.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS17.00軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,各組實驗數(shù)據(jù)均以(±s)表示,各組間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 小鼠最佳給酒量的篩選

與其他劑量相比,灌胃0.14ml/10g劑量的56°紅星二鍋頭酒能夠得到理想的醉酒例數(shù),同時醉酒潛伏期較短且無死亡現(xiàn)象。故本實驗選用0.14ml/10g劑量進行急性酒精中毒實驗的最佳給酒劑量(見表1)。

表1 小鼠最佳給酒量的選擇

3.2 對醉酒潛伏期、醉酒率、死亡情況的影響

與模型組相比,陽性組、白花鬼針草提取液低、中劑量組均能延長小鼠的醉酒潛伏期,提高小鼠對酒精的耐受能力(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),但陽性組的效果更為明顯;白花鬼針草提取液高劑量組無明顯差異但也表現(xiàn)出延長潛伏期的趨勢,各組均無死亡例數(shù)(見表2)。

3.3 對血清AST、ALT的影響

與正常組相比,模型組的AST、ALT活性增高(P＜0.01,P＜0.05)。與模型組相比,陽性組的AST、ALT具有顯著性差異(P＜0.01,P＜0.01),白花鬼針草提取液低劑量的AST、ALT具有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.05)(見表3)。

表3 白花鬼針草提取液對急性酒精中毒小鼠血清AST、ALT的影響(±s)

表3 白花鬼針草提取液對急性酒精中毒小鼠血清AST、ALT的影響(±s)

注：與正常組相比,?為P＜0.05,??為P＜0.01;與模型組相比,#為P＜0.05,##為P＜0.01

組別 n ALT(U/L) AST(U/L)正常組 14 42.05±11.23 24.45±5.65模型組 14 52.80±14.42? 35.62±9.86??陽性組 14 40.85±9.02## 24.02±6.45##低劑量組 14 44.01±10.79# 28.07±7.55#中劑量組 14 47.10±10.32 29.99±8.97高劑量組 14 48.52±12.91 33.49±7.01

3.4 對肝組織ADH、GSH、SOD、MDA的影響

與正常組相比,模型組GSH含量、ADH、SOD活性均下降(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),MDA水平升高(P＜0.05)。與模型組相比,陽性組的ADH、GSH、SOD及MDA具有顯著性差異(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01),白花鬼針草低、中劑量組的ADH具有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.05)白花鬼針草低劑量組的GSH具有顯著性差異(P＜0.05),白花鬼針草低、中及高劑量組的SOD具有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05),白花鬼針草低、中劑量組的MDA具有顯著性差異(P＜0.01,P＜0.05)。與陽性組相比,白花鬼針草中劑量組對肝組織中SOD活性的提高幾乎相當;白花鬼針草低劑量組對肝組織中MDA水平的降低優(yōu)于陽性組(見表4)。

表4 白花鬼針草提取液對急性酒精中毒小鼠肝組織ADH、GSH、SOD、MDA的影響(±s)

表4 白花鬼針草提取液對急性酒精中毒小鼠肝組織ADH、GSH、SOD、MDA的影響(±s)

注：與正常組相比,?為P＜0.05,??為P＜0.01;與模型組相比,#為P＜0.05,##為P＜0.01

組 別 n ADH(U/ml) GSH(mol/l) SOD(U/ml) MDA(mol/l)正常組 14 4.21±1.32 9.78±3.35 122.80±25.21 4.06±1.15模型組 14 2.89±0.53?? 5.06±1.80?? 104.32±19.38? 5.18±1.27?陽性組 14 4.38±1.20## 9.56±3.15## 129.54±22.46## 3.93±0.94##低劑量組 14 3.88±1.46# 8.51±4.96# 124.95±22.87# 3.97±1.29##中劑量組 14 3.76±1.34# 7.69±2.82 125.72±21.66## 4.12±1.07#高劑量組 14 2.99±0.71 6.73±3.72 121.09±14.45# 4.68±1.28

4 結果與討論

目前,對于保肝、防治急性酒精中毒的研究,西方國家以合成藥物為主,而東方國家以天然植物開發(fā)為主[8]。防治急性酒精中毒的機制主要是通過減少酒精吸收,降低血中酒精及相關代謝產(chǎn)物的濃度,減緩對臟器造成的損害[9]。本實驗中,陽性組、白花鬼針草提取液低、中劑量組均能延長小鼠的醉酒潛伏期(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),結果表明三者能夠減少酒精的吸收,有效的提高小鼠對酒精的耐受能力,但白花鬼針草提取液的效果不如海王金樽的效果明顯。

AST和ALT是存在于肝細胞胞質(zhì)內(nèi)重要的轉(zhuǎn)氨酶,主要是用于檢測肝功能的常用指標,當肝臟受到損傷出現(xiàn)炎癥反應或者壞死時,肝細胞膜破裂后將轉(zhuǎn)氨酶釋放入血液,此時血液中的AST和ALT將會升高,其數(shù)值表示肝臟損害的程度[10,11]。本實驗中,模型組ALT、AST含量顯著增高,提示急性酒精中毒小鼠出現(xiàn)肝臟嚴重損傷的現(xiàn)象,表現(xiàn)為肝功能異常,而與陽性組的AST、ALT與模型組相比具有顯著性差異(P＜0.01,P＜0.01),提示陽性組能明顯降低血清AST、ALT的活性;白花鬼針草提取液低劑量的AST、ALT與模型組相比具有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.05),結果表明其能降低血清AST、ALT的活性,能夠?qū)辜毙跃凭卸舅碌母闻K嚴重損傷,減輕肝組織損傷所引起的炎癥反應或壞死程度,具有一定的改善肝功能的作用;但與陽性組相比,海王金樽片的效果優(yōu)于白花鬼針草提取液低劑量組的效果。

肝組織內(nèi)存在乙醇脫氫酶(ADH),是機體內(nèi)主要參與酒精代謝的酶,吸收后在肝臟代謝的酒精經(jīng)ADH多次催化氧化后形成中間產(chǎn)物進入三羧酸循環(huán),并以二氧化碳和水的形式排泄[12]。其中經(jīng)代謝所產(chǎn)生的部分中間產(chǎn)物可損傷肝細胞、影響三羧酸循環(huán)以及損傷組織再生修復[13]。因此,通過提高肝細胞內(nèi)ADH的活性,可加速酒精的代謝,減輕酒精及其代謝過程產(chǎn)生的中間產(chǎn)物對機體臟器所致的傷害。本實驗中,模型組ADH活性明顯下降(P＜0.01),陽性組、白花鬼針草提取液低、中劑量組ADH活性上升(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),陽性組的效果更為明顯,結果表明在急性酒精中毒狀態(tài)下,白花鬼針草提取液能夠提高肝組織ADH的活性,加速酒精在體內(nèi)的代謝過程。

過量飲酒后酒精的吸收遠大于代謝,大量吸收后的酒精經(jīng)過循環(huán)作用使得機體產(chǎn)生過多自由基,從而對臟器具有損傷的作用[14]。GSH是機體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑,具有整合解毒的作用,通過與自由基等有害物質(zhì)結合后轉(zhuǎn)化成無害物質(zhì)。SOD是生物體內(nèi)重要的酶自由基清除劑,直接反映機體抵抗氧化的水平,有效清除機體內(nèi)過量的自由基,MDA是活性氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應的主要生成物之一,它的含量能夠間接表現(xiàn)機體抗氧化能力及清除氧化生成物的能力[15,16]。因此,通過提高機體內(nèi)SOD活性和增加GSH含量,減少MDA的水平,可以有效地減輕急性酒精中毒引起的臟器損害。本實驗中,陽性組和白花鬼針草低、中及高劑量組SOD活性升高(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05),尤以陽性組、中劑量組較為顯著;陽性組、白花鬼針草低、中劑量組MDA含量下降(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),以陽性組和低劑量組效果更佳;陽性組和白花鬼針草低劑量組GSH水平增加(P＜0.01,P＜0.05),結果表明白花鬼針草提取液能促進急性酒精中毒小鼠清除自由基,增強抗氧化的能力,對急性酒精性肝損傷有一定的保護作用。

5 結論

白花鬼針草提取液對小鼠急性酒精性肝損傷有一定的保護作用,可能與提高小鼠對酒精的耐受能力、減輕酒精對肝組織損傷所引起的炎癥反應或壞死程度、加快酒精在體內(nèi)的代謝速度、增強抗氧化能力和清除體內(nèi)自由基能力有關;究竟是白花鬼針草提取液中的哪些有效成分在發(fā)揮作用,有待進一步研究。