武鴻彪 袁旦平 曹躍鵬 龐洪雙 劉東方 傅超 陶勇

結(jié)直腸癌是目前臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，且死亡率逐年上升[1]。近年來(lái)，盡管結(jié)直腸癌的手術(shù)方式、放化療及靶向藥物治療等研究均取得了較大進(jìn)展，但患者預(yù)后依然欠佳。因此，進(jìn)一步分析影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)因素，尋找有助于臨床診治的指標(biāo)、標(biāo)志物或新靶點(diǎn)是目前臨床研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)[2]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移涉及基因突變、內(nèi)環(huán)境改變、細(xì)胞信號(hào)通路異常、免疫系統(tǒng)失調(diào)等多個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，相應(yīng)血清標(biāo)志物亦能監(jiān)測(cè)其變化[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族成員，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可促使腫瘤細(xì)胞沿基底膜向周圍組織浸潤(rùn)，加速腫瘤形成或擴(kuò)散[4]。同時(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）為組織金屬蛋白酶抑制劑家族的一員，由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞合成，可通過(guò)與活化的MMP-9或與MMP-9潛酶結(jié)合等方式，阻斷其過(guò)度活化，是MMP-9的天然抑制劑[5]。鈣黏附蛋白E（E-cadherin）參與降低腫瘤細(xì)胞間的粘連，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。基于此，本研究采用ELISA法檢測(cè)結(jié)直腸癌患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin 水平，分析其與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2010年1月至2013年1月本院肛腸外科收治的行手術(shù)切除治療并經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)結(jié)直腸癌患者102例。其中男71例，女31例；年齡45～80（62.11±14.27）歲；結(jié)腸癌70例，直腸癌32例。患者術(shù)后按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）結(jié)直腸癌TNM分期，Ⅰ期14例，Ⅱ期29例，Ⅲ期39例，Ⅳ期20例。所有患者均排除心、肝、腎等重要器官疾病，無(wú)合并嚴(yán)重內(nèi)科疾病，無(wú)其他部位原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平檢測(cè) 采集患者術(shù)前空腹靜脈血4 ml于專用血清采集管中，室溫靜置 1 h 后離心（4℃，1 600 g，10 min），吸取上清液于-80℃保存，使用前置于冰上溶解。MMP-9、TIMP-1及E-cadherin ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程公司，按說(shuō)明書指導(dǎo)加入標(biāo)本稀釋液與定量標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔每孔加入50μl樣品稀釋液及50μl標(biāo)本，然后分別加入50μl人抗MMP-9、TIMP-1及E-cadherin抗體。酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTech公司）檢測(cè)各孔標(biāo)本吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各標(biāo)本MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平。

1.2.2 臨床特征收集 記錄患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤分級(jí)、腫瘤TNM分期等臨床特征資料。

1.2.3 預(yù)后觀察 患者術(shù)后隨訪由專門的隨訪小組通過(guò)電話、信函及門診等方式進(jìn)行，記錄患者腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和死亡時(shí)間，隨訪截止至2018年1月，觀察并記錄患者無(wú)復(fù)發(fā)生存情況與總生存情況。無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間是指手術(shù)之日起至第1次出現(xiàn)腫瘤局部或區(qū)域復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、隨訪終止的時(shí)間；總生存時(shí)間是指手術(shù)之日起至患者死亡、隨訪終止的時(shí)間。

1.3 觀察指標(biāo) （1）觀察患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平預(yù)測(cè)預(yù)后的最佳截點(diǎn)：通過(guò)繪制ROC曲線計(jì)算患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平預(yù)測(cè)預(yù)后（隨訪5年生存或死亡）的最佳截點(diǎn)，并以此將患者分為高（≥截點(diǎn)）與低（＜截點(diǎn)）MMP-9組、TIMP-1組、E-cadherin組。（2）比較高M(jìn)MP-9組與低MMP-9組、高TIMP-1組與低TIMP-1組、高E-cadherin組與低E-cadherin組患者臨床特征、無(wú)復(fù)發(fā)生存情況與總生存情況。（3）分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組患者生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)；單因素與多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平預(yù)測(cè)預(yù)后的最佳截點(diǎn) 以隨訪5年患者是否生存為結(jié)果，繪制患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC曲線，見(jiàn)圖1-3。

圖1 結(jié)直腸癌患者血清MMP-9水平預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC曲線

圖2 結(jié)直腸癌患者血清TIMP-1水平預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC曲線

圖3 結(jié)直腸癌患者血清E-cadherin水平預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC曲線

由圖 1-3可見(jiàn)，患者血清 MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平預(yù)測(cè)預(yù)后的 AUC分別為 0.677、0.714、0.654，根據(jù)AUC及相應(yīng)約登指數(shù)計(jì)算出最佳截點(diǎn)分別為 190、145、73ng/ml。

2.2 高與低MMP-9組、TIMP-1組、E-cadherin組患者臨床特征比較 見(jiàn)表1。

表1 高與低MMP-9組、TIMP-1組、E-cadherin組患者臨床特征比較[例（%）]

由表1可見(jiàn)，高M(jìn)MP-9組與低MMP-9組、高TIMP-1組與低TIMP-1組、高E-cadherin組與低E-cadherin組患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），腫瘤TNM分期、腫瘤T期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。高M(jìn)MP-9組與低MMP-9組、高TIMP-1組與低TIMP-1組患者腫瘤N期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 高與低MMP-9組、TIMP-1組、E-cadherin組患者無(wú)復(fù)發(fā)生存情況與總生存情況比較 見(jiàn)圖4-9。

圖4 高M(jìn)MP-9組與低MMP-9組患者無(wú)復(fù)發(fā)生存曲線比較

圖5 高M(jìn)MP-9組與低MMP-9組患者總生存曲線比較

圖6 高TIMP-1組與低TIMP-1組患者無(wú)復(fù)發(fā)生存曲線比較

圖7 高TIMP-1組與低TIMP-1組患者總生存曲線比較

圖8 高E-cadherin組與低E-cadherin組患者無(wú)復(fù)發(fā)生存曲線比較

圖9 高E-cadherin組與低E-cadherin組患者總生存曲線比較

由圖4-9可見(jiàn)，患者隨訪15～60（中位數(shù)43）個(gè)月，其中失訪6例（其中包括非腫瘤相關(guān)死亡）。高M(jìn)MP-9組與低MMP-9組、高TIMP-1組與低TIMP-1組、高E-cadherin組與低E-cadherin組患者5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為24.49%與61.61%、22.53%與61.16%、19.09%與25.31%，5年總生存率分別為24.24%與59.73%、17.69%與50.17%、51.87%與25.91%。高M(jìn)MP-9組患者5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率與5年總生存率均低于低MMP-9組患者（均P＜0.05）。高TIMP-1組患者5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率與5年總生存率均低于低TIMP-1組患者（均P＜0.05）。高E-cadherin組患者5年總生存率高于低E-cadherin組（P＜0.05），高E-cadherin組與低E-cadherin組患者5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響因素分析 以隨訪5年患者是否無(wú)復(fù)發(fā)生存、是否生存為結(jié)果，分析影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因素 見(jiàn)表2、3。

由表2、3可見(jiàn)，結(jié)直腸癌患者腫瘤TNM分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性及高TIMP-1水平均是影響患者無(wú)復(fù)發(fā)生存和總生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）。

3 討論

惡性腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是其主要生物學(xué)特征，影響患者治療效果和預(yù)后。浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜、多步驟的腫瘤細(xì)胞與機(jī)體間互相作用的連續(xù)過(guò)程。有學(xué)者提出了腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移機(jī)制的三步學(xué)說(shuō)，即黏附、降解和移動(dòng)，不僅從理論上闡明了浸潤(rùn)的可能步驟，而且涉及腫瘤細(xì)胞穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)屏障、基底膜、血管壁及穿出血管壁進(jìn)入機(jī)體微環(huán)境的過(guò)程[6]。MMP系統(tǒng)、黏附分子及其它生物因子對(duì)此過(guò)程起重要調(diào)控作用，已成為目前臨床腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在某種特殊聯(lián)系機(jī)制。Patil等[7]研究非轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)化癌細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞分泌MMP-9，剪切細(xì)胞原癌基因蛋白E-cadherin，進(jìn)而證實(shí)癌細(xì)胞可誘導(dǎo)腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。同時(shí)，MMP可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，調(diào)節(jié)血管生成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程。TIMP-1通過(guò)與作為重要調(diào)節(jié)劑的MMP結(jié)合起作用，并且可以抑制MMP的蛋白水解活性[8]。這種平衡遭到打破可能導(dǎo)致早期腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平，旨在分析其與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

表2 結(jié)直腸癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存預(yù)后的影響因素分析

表3 結(jié)直腸癌患者總生存預(yù)后的影響因素分析

有文獻(xiàn)指出，在乳腺癌、胰腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中，MMP-9呈高表達(dá)，其具有降解蛋白聚糖、層粘連蛋白等的作用[9]。本研究從臨床表型入手，以更大的樣本量通過(guò)ELISA法分析血清MMP-9水平，結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌患者中呈高表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致。MMP-9參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：破壞基質(zhì)降解平衡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成的屏障，重整細(xì)胞之間的黏附關(guān)系并向周圍組織浸潤(rùn)、侵襲，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子發(fā)揮協(xié)同作用，促使新生血管生成[10]。一項(xiàng)Meta分析顯示，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性及高TNM分期的結(jié)直腸癌患者血清MMP-9存在高表達(dá)水平，進(jìn)一步說(shuō)明其可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞向腸壁深層浸潤(rùn)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵襲[11]。本研究結(jié)果顯示，血清MMP-9水平與腫瘤自身屬性比如腫瘤分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性等有關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn)，不同血清MMP-9水平患者5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率與總生存率均存在差異，提示MMP-9具有較好的臨床預(yù)測(cè)預(yù)后價(jià)值。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，與無(wú)肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸患者相比，結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移的患者血清MMP-9水平明顯升高[12]。

TIMP是一組抑制MMP活性的低分子量蛋白，尤其是TIMP-1，可通過(guò)活化的間質(zhì)膠質(zhì)酶、活化的間質(zhì)溶解素和 MMP-9以1∶1非共價(jià)鍵形成復(fù)合物，在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起抗浸潤(rùn)和抗轉(zhuǎn)移的作用[13]。腫瘤惡變時(shí)MMP-9增高，反應(yīng)性地調(diào)節(jié)升高TIMP-1，提示腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)不單需要降解周圍基質(zhì)，而且還需要依靠MMP-9/TIMP-1系統(tǒng)重建微環(huán)境和調(diào)節(jié)微血管形成[14]。TIMP-1可抑制腫瘤組織的血管生成，有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[15]。TIMP-1與MMP-9系統(tǒng)失衡會(huì)直接影響腫瘤的發(fā)展、侵襲、預(yù)后。本研究結(jié)果顯示血清TIMP-1水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度有關(guān)，說(shuō)明TIMP-1參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。多因素分析顯示，TIMP-1、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。換而言之，結(jié)直腸癌患者血清TIMP-1水平升高可能提示患者預(yù)后不良。

除此之外，本研究也探討了E-cadherin在結(jié)直腸癌患者中表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin是一個(gè)抑癌基因，其功能異常與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[16]。Palaghia等[17]通過(guò)對(duì)結(jié)直腸腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤細(xì)胞分化程度的降低、腫瘤直徑的增大、浸潤(rùn)深度加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期進(jìn)展，E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率會(huì)隨之降低。E-cadherin表達(dá)缺失并可轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)組織鈣黏蛋白N-cadherin，而后者的重新表達(dá)被視為結(jié)直腸癌中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的明確特征[18]。N-cadherin還與間質(zhì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞相互作用，利于腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[19]。本研究結(jié)果顯示，血清E-cadherin水平與腫瘤分期及浸潤(rùn)深度密切有關(guān)，而多因素分析顯示E-cadherin并非是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，E-cadherin水平與結(jié)直腸癌患者5年總生存率有關(guān)。因此，通過(guò)檢測(cè)血清E-cadherin水平，及時(shí)對(duì)預(yù)后較差的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行有效的治療，可延長(zhǎng)患者的生存期。

綜上所述，血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值，高血清MMP-9、TIMP-1及低E-cadherin水平患者提示預(yù)后不良。