費新茹 朱 娟 郭 暉 郭 紅 呂 超 郭寶健 許如根,*

(1 揚州大學(xué)大麥研究所/江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點實驗室，江蘇 揚州 225009；2 鹽都區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224011；3 江蘇省農(nóng)墾農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司，江蘇 南京 210008)

大麥(HordeumvulgareL.)為禾本科大麥屬一年生草本植物，是世界第四大禾谷類作物，總產(chǎn)量和種植面積僅次于小麥、水稻和玉米[1]。大麥因具有豐富的膳食纖維、高β-葡聚糖含量等營養(yǎng)成分，可作為飼料、糧食、啤酒工業(yè)原料和保健用品等，受到了人們廣泛的關(guān)注[2]。然而近年來，大麥白粉病(barley powdery mildew)的發(fā)生和傳播嚴(yán)重影響了大麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。大麥白粉病是由大麥?；突铙w寄生菌布氏白粉菌(Blumeriagraminisf. sp.hordei，Bgh)引起的真菌病害，可造成20%～30%的產(chǎn)量損失[3]，是世界大麥主產(chǎn)區(qū)的主要病害之一[4]。因此，培育并推廣抗白粉病品種是防治大麥白粉病最經(jīng)濟(jì)有效的手段。

目前已有關(guān)于大麥白粉病抗性遺傳[5-6]、基因定位[7-8]的研究報道。如嚴(yán)雋析[9]研究發(fā)現(xiàn)大麥白粉病抗性由單個顯性基因或2對基因控制；俞志隆等[10]研究認(rèn)為大麥白粉病田間抗性受多基因控制；黃金堂[11]研究認(rèn)為大麥白粉病抗性遺傳符合加性-顯性遺傳模型，且加性效應(yīng)作用更明顯。大麥對白粉菌的抗性主要受?；钥共』虻目刂?，目前已鑒定到100多個抗性基因，其中22個?；钥共』蚍植加诓煌娜旧w上[12]。研究表明，某些抗病基因存在多個不同的復(fù)等位基因，如Weibull 等[[13]在Mla基因座共鑒定出32個抗性復(fù)等位基因。大麥野生型Mlo基因位點通過突變可以產(chǎn)生一系列不同的mlo隱性等位基因，mlo基因介導(dǎo)大麥幾乎對目前已知的所有Bgh生理小種都有抗性[14]。

隨著大麥白粉病病原菌生理小種的不斷分化，新菌株可能導(dǎo)致原有抗病品種的抗性下降甚至喪失。為確保大麥生產(chǎn)上應(yīng)用品種的大麥白粉病抗性，必須不斷鑒定發(fā)掘新的大麥白粉病抗性基因并在育種中加以利用[15]。本研究以1個大麥白粉病抗感DH群體及其親本為試驗材料，對其大麥白粉病抗性進(jìn)行遺傳分析與QTL定位，以期為大麥白粉病抗性基因的精細(xì)定位及分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 以含173個DH系的DH群體及其親本為試驗材料，該DH群體是以揚飼麥1號×Gairdner雜交F1的花藥經(jīng)組織培養(yǎng)、染色體加倍等技術(shù)構(gòu)建的，其中母本為感大麥白粉病六棱飼料大麥揚飼麥1號，父本為抗大麥白粉病二棱啤酒大麥Gairdner，均由澳大利亞塔斯馬尼亞大學(xué)周美學(xué)教授惠贈。

1.1.2 田間種植 于2014年秋季將試驗材料播種于揚州大學(xué)大麥試驗田。每材料人工點播兩行，行長1.2 m，株距0.03 m, 行距0.2 m，每行點播40粒，并設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。田間管理同大田常規(guī)栽培方法。

1.2 方法

1.2.1 抗性鑒定方法 大麥白粉病病級調(diào)查參照Li等[16]的方法，在大麥白粉病發(fā)病始期(抽穗期)開始調(diào)查，每隔7 d調(diào)查1次，連續(xù)調(diào)查3期。每個株系連續(xù)調(diào)查10株。根據(jù)葉片病斑的有無、大小及發(fā)病部位，將大麥白粉病病級分為6級(詳見表1)。2015年4月上旬和中旬，揚州為多雨天氣，隨著氣溫逐漸上升(>15℃)，田間溫度和相對濕度較適宜大麥白粉病的發(fā)生，大麥白粉病的發(fā)病程度隨著調(diào)查時期延長而加重。按照公式計算大麥白粉病病情指數(shù)(disease index, DI)[11]：

式中，x代表每個調(diào)查植株抗性級別(0、1、2、3、4、5級)；n代表各病級的植株數(shù)量；N代表所調(diào)查的總植株數(shù)。

1.2.2 DH群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建方法 篩選親本間多態(tài)性好的SSR標(biāo)記，利用這些多態(tài)性標(biāo)記對親本及173個DH系進(jìn)行基因型鑒定，與揚飼麥1號相同的帶型記為0，與Gairdner相同的帶型記為2，雜合或缺失記為1。利用JoinMap 4.0 軟件構(gòu)建DH群體的分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜。

1.2.3 QTL定位方法 利用1年3個時期的數(shù)據(jù)，采用Windows QTL IciMapping 4.0軟件[17]中的完備區(qū)間-加性模型(inclusive composite interval-additive mapping，ICIM-ADD)定位方法，掃描步長為1 cM，以LOD值2.5作為閾值[18]，QTL的命名遵循McCouch[19]的原則。

表1 大麥白粉病病級劃分Table 1 The resistance level of barley powdery mildew

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2016對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用 SPSS 16.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對雙親及DH群體進(jìn)行抗性差異的統(tǒng)計分析。親本大麥白粉病抗性差異采用t測驗分析，DH群體大麥白粉病抗性差異采用方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DH群體及其親本大麥白粉病病情指數(shù)的差異性分析

2.1.1 DH群體及其親本病情指數(shù)的表現(xiàn) 由表2可知，3個調(diào)查時期大麥白粉病病情指數(shù)在親本間均存在極顯著差異，其中親本及DH群體大麥白粉病病情指數(shù)平均值均以第三期最高。從DH群體變異系數(shù)和變幅來看，3個調(diào)查時期白粉病病情指數(shù)在DH群體內(nèi)存在廣泛的變異，且存在不同程度的超高親或超低親遺傳現(xiàn)象。

由圖1可知，3個時期DH群體的大麥白粉病病情指數(shù)均呈連續(xù)性分布，表明可進(jìn)一步對大麥白粉病抗性進(jìn)行QTL定位。

2.1.2 DH群體病情指數(shù)的方差分析 由表3可知，白粉病病情指數(shù)在調(diào)查時期間、DH系間及基因型與調(diào)查時期互作間的差異均達(dá)到極顯著水平，表明白粉病病情指數(shù)在DH群體各系間存在豐富的遺傳變異。同時，DH群體發(fā)病程度還受不同調(diào)查時期氣候條件的影響。

表2 親本及DH群體的病情指數(shù)Table 2 DI of DH population and its parents

注：**表示在0.01水平差異顯著。下同。

Note:**indicates significant difference at 0.01 level. The same as following.

注：A:第一期病情指數(shù);B:第二期病情指數(shù);C：第三期病情指數(shù)。紅色箭頭代表揚飼麥1號；藍(lán)色箭頭代表Gairdner。Note:A：DI of stage Ⅰ.B:DI of stageⅡ. C:DI of stage Ⅲ. The red arrow represents Yangsimai 1. The blue arrow represents Gairdner.圖1 DH群體白粉病病情指數(shù)頻數(shù)分布Fig.1 Frequency distribution of the DI in DH population

2.2 DH群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建與大麥白粉病抗性QTL定位

2.2.1 DH群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建 由表4可知，對揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院大麥研究所保存的1 008個SSR標(biāo)記在親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，獲得91對多態(tài)性好的SSR標(biāo)記。利用這些多態(tài)性標(biāo)記對親本及173個DH系進(jìn)行基因型鑒定，構(gòu)建了覆蓋大麥全基因組 1 161.99 cM的遺傳連鎖圖譜，圖譜包含91對SSR標(biāo)記，較均勻分布于大麥7條染色體上，標(biāo)記間平均遺傳距離為12.77 cM，平均每條染色體上標(biāo)記個數(shù)為13個。

表4 大麥DH群體遺傳圖譜各染色體的長度及標(biāo)記數(shù)Table 4 The length of chromosome and number of marks in barley DH population

2.2.2 大麥白粉病抗性QTL定位 由表5可知，3個調(diào)查時期共檢測到5個與大麥白粉病抗性相關(guān)的QTLs，分布于第2、第3和第4號染色體上，分別為qPM-2Ha、qPM-2Hb、qPM-3Ha、qPM-4Ha和qPM-4Hb。第2號染色體上的qPM-2Ha在3個調(diào)查時期均被檢測到，位于Bmag0711-AWBMS56標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋7.48%～12.50%的表型變異；qPM-2Hb在第一期和第二期檢測到，位于Bmag0749-GBM1475標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋6.22%～8.13%的表型變異。第3號染色體上的qPM-3Ha僅在第三期檢測到，位于EBmac0705-HVLTPPB.2標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋3.97%的表型變異。第4號染色體上的qPM-4Ha在3個調(diào)查時期均被檢測到，位于EBmac0906-HVM68標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋23.07%～32.09%的表型變異；qPM-4Hb僅在第三期檢測到，位于GBM1388-HDAMYB標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，可解釋13.34%的表型變異。qPM-2Ha、qPM-4Ha及qPM-2Hb的加性效應(yīng)均為負(fù)值，說明其白粉病抗性基因均來源于抗病親本Gairdner；qPM-3Ha和qPM-4Hb的加性效應(yīng)均為正值，說明其白粉病抗性基因來源于感病親本揚飼麥1號。

表5 大麥白粉病抗性QTLs在染色體上的位置及效應(yīng)分析Table 5 The chromosome positions and effects analysis of barley powdery mildew resistance QTLs

3 討論

大麥白粉病是由布氏白粉菌屬大麥?；突铙w寄生菌引起的真菌病害，其流行程度主要與寄主抗病性、氣候條件、栽培措施等密切相關(guān)[5,15]。寄主抗病性一方面取決于是否具有抗病基因，另一方面也受株型和群體結(jié)構(gòu)的影響，如抗病品種病菌形成緩慢，且發(fā)病輕；葉片直立生長、長且窄的品種通常發(fā)病也較輕[20]。此外，白粉病發(fā)病程度受溫度、濕度、光照等氣候條件影響較大[20]。白粉病發(fā)生適溫為15～20℃，低于10℃時發(fā)病緩慢，低于0℃或高于28℃不發(fā)??；高濕條件有利于發(fā)病，相對濕度大于70%有可能引起病害流行；白粉病病菌的分生孢子對直射陽光較敏感，散射光有利于病害發(fā)生[20-21]。播種量大，田間植株密度大會加重白粉病[22]。若施用氮肥過多，會造成植株貪青、徒長等利于白粉病的發(fā)生[22]；而水肥不足、土壤干旱、植株生長衰弱、抵抗力低也利于該病發(fā)生[20]。本研究中親本和DH群體在3個調(diào)查時期白粉病發(fā)病程度呈逐漸加重的趨勢，這與發(fā)病期間氣溫逐漸上升、雨水勻和利于白粉菌侵染大麥相關(guān)。

大麥白粉病一般表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量性狀，同時受環(huán)境及基因與環(huán)境互作的影響[10]。目前，已有部分大麥白粉病抗性QTLs被定位[23-24]、克隆[25-26]并應(yīng)用于大麥品種改良[27-28]。本研究檢測到的部分QTLs與已報道的基因可能是等位基因或同一基因，如qPM-2Ha在染色體上的位置與Hilbers等[29]利用Ris03S×Sultan 和Alf ×Vogelsanger Gold 2構(gòu)建的2套DH群體定位到的位于RFLP分子標(biāo)記cMWG660與MWG97之間的抗白粉病基因MlLa位置相近，表明其可能是MlLa的等位基因。qPM-4Ha的位置與G?rg等[30]利用大麥近等基因系定位到與RFLP分子標(biāo)記MWG032共分離的抗白粉病基因Mlg位置相近，即其可能是Mlg的等位基因。Hinze等[31]利用6個不同基因型的大麥品種構(gòu)建的回交群體定位到第4號染色體上，與RFLP分子標(biāo)記bAL88/2共分離的抗白粉病基因mlo，qPM-4Hb與mlo位置相近，可能是其等位基因。第2號染色體上qPM-2Hb和第3號染色體上qPM-3Ha所在區(qū)域至今沒有相關(guān)的白粉病QTL報道，可能是新的抗大麥白粉病QTL位點，但尚需進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

本研究共檢測到5個與大麥白粉病抗性相關(guān)的QTLs，其中qPM-2Ha、qPM-4Ha和qPM-4Hb與已報道的基因可能是等位基因或同一基因，位于第2號染色體上qPM-2Hb和位于第3號染色體上qPM-3Ha所在區(qū)域目前尚沒有相關(guān)的白粉病抗性位點報道，可能是新的抗大麥白粉病QTL位點。本研究結(jié)果為大麥白粉病抗性QTL的發(fā)掘、基因精細(xì)定位、基因克隆和分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定了一定的理論基礎(chǔ)。