鄧 慶，馬 健

(1.錦江生殖成都西囡婦科醫(yī)院檢驗科,四川成都 610000；2.四川錦欣婦女兒童醫(yī)院檢驗科,成都 610000)

羅氏易位指2個近端著絲粒染色體在著絲處或其附近斷裂后融合成為1個染色體，導(dǎo)致染色體數(shù)減少，長臂數(shù)不變，短臂數(shù)減少2條的現(xiàn)象。羅氏易位發(fā)生在5條近端著絲粒染色體(13、14、15、21、22號染色體)上，羅氏易位攜帶者只有45條染色體，缺少1條染色體[1]。其人群攜帶率為1.23/1 000，占不孕人群的2%～3%[2]。

一般而言，發(fā)生羅氏易位的5條染色體短臂的丟失不會對個體發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響。雖然表型正常，由于在第1次減數(shù)分裂過程中羅氏易位攜帶者生殖細(xì)胞易位染色體和相應(yīng)2個正常染色體配對會形成3價染色體，這種結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致交替、鄰式和不常見3∶0 3種分裂方式的出現(xiàn)[3]。只有交替可產(chǎn)生正?；蚱胶獾呐渥?，其他2種方式產(chǎn)生非平衡的配子，一旦羅氏易位攜帶者與健康者婚配，這種占大部分的非平衡配子可能會導(dǎo)致易位攜帶者出現(xiàn)妊娠困難或妊娠過程中反復(fù)流產(chǎn)，甚至?xí)?dǎo)致21-三體綜合征、13-三體綜合征等先天缺陷患兒的出生[4]。

羅氏易位是導(dǎo)致不孕及妊娠質(zhì)量不高的一種家族遺傳性疾病[5]。本研究選取一對有過胚胎停育和自然流產(chǎn)史、女方屬高齡產(chǎn)婦、男方攜帶羅氏易位衍生染色體的夫婦，通過對其體外受精得到的胚胎進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測，通過一定的分析方法進(jìn)行比對驗證從而挑選出正常合適的胚胎進(jìn)行移植，可避免臨床上羅氏易位攜帶者異常胚胎植入后的選擇性終止妊娠，大幅度降低了婦女身心痛苦和妊娠失敗風(fēng)險，阻斷羅氏易位疾病的垂直傳播[6]；減輕社會和家庭負(fù)擔(dān)。

1 資料與方法

1.1樣本來源 女方37歲，1次胚胎停育，3次自然流產(chǎn)。男女雙方染色體核型分析：女方核型正常，男方羅氏易位攜帶45，XY，-13,-14，+Rob(13∶14)。申請胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)技術(shù)助孕，采用促排卵方案后采卵1次，體外受精得到囊胚4枚，通過胚胎活檢對4個囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行采樣同時采取夫妻雙方外周血基因組樣本，通過達(dá)瑞生殖PGS檢測篩查出染色體不平衡胚胎，并經(jīng)倫理學(xué)審查和達(dá)瑞生殖技術(shù)性手段胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)來檢測與構(gòu)建受檢胚胎的單體型。

1.2儀器及耗材 REPLI-g?single Cell Kit(24)購自QIAGEN企業(yè)管理(上海)有限公司，Ion AmpliseqTMLibrary Kit 2.0購自美國life公司，Agencourt AMPure XP購自美國BECKMAN公司，QubitTMdsDNA HS Assay Kit購自美國Life公司，KAPA SYBR?FAST Universal qPCR Kit購自美國KAPA公司，PCR擴增反應(yīng)試劑購自日本TaKaRa，所有引物合成自美國invitrogen公司，測序試劑均購自美國life公司。Qubit?3.0 Fluorometer熒光計購自美國Life公司，定性PCR儀(ABI3130)、實時熒光定量PCR儀(ABI7500)均購自美國ABI公司，DA8600半導(dǎo)體測序儀購自美國Life公司。

1.3方法

1.3.1單細(xì)胞全基因組擴增 基于準(zhǔn)隨機引物線性擴增的原理并根據(jù)單細(xì)胞全基因組擴增試劑盒(REPLI-g?single Cell Kit)說明書對每個囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解、預(yù)擴增、指數(shù)擴增和擴增產(chǎn)物純化，產(chǎn)物濃度稀釋10倍后經(jīng)熒光定量儀(Qubit 3.0)測濃度。

1.3.2文庫構(gòu)建 100 ng DNA經(jīng)文庫構(gòu)建試劑盒(Ion AmpliseqTMLibrary Kit 2.0)構(gòu)建文庫DNA。PCR特異性擴增目的片段，在DNA片段兩端加上通用測序接頭，PCR擴增文庫DNA，磁珠純化去除雜質(zhì)；文庫構(gòu)建后Qubit 3.0測濃度。多重PCR所需引物250對均用Ampliseq網(wǎng)站設(shè)計，由invitrogen公司合成。

1.3.3高通量測序文庫qPCR定量 根據(jù)Qubit 3.0測定的濃度結(jié)果，取2 μL文庫樣品稀釋至200 pM。根據(jù)實時定量PCR試劑盒(KAPA SYBR?FAST Universal qPCR Kit)配制反應(yīng)總體系。稀釋后的文庫樣品和標(biāo)準(zhǔn)品各取4 μL進(jìn)行定量。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)循環(huán)數(shù)計算每個文庫樣本的實際濃度。

1.3.4上機模板制備與測序 根據(jù)每個樣本測序數(shù)據(jù)量和測序深度確定文庫的混樣個數(shù)進(jìn)行模板制備，使用模板制備試劑盒(Ion PGMTM Template OT2 200 kit)制備測序模板；然后進(jìn)行陽性模板的富集即去除雜質(zhì)及擴增失敗的測序模板；最后使用高通量測序試劑盒(Ion PGMTM Sequencing 200 kit v2)在 PGMTM測序平臺上進(jìn)行測序。

1.4數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)下機后進(jìn)行生物信息分析。首先對下機的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行測序質(zhì)量評估，去除接頭序列，通過Torrent Mapping Alignment Program軟件比對到人類基因組參考序列hg19上，通過samtools統(tǒng)計覆蓋倍數(shù)，通過GATK calling SNP基因型分析，最后結(jié)合家系進(jìn)行SNP連鎖分析，對患者樣本13、14號染色體進(jìn)行單體型構(gòu)建，進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié) 果

2.1胚胎測序結(jié)果分析 下一代測序(NGS)檢測結(jié)果匯總見表1。F為父親樣本，M為母親樣本，F(xiàn)1、F2為父親樣本13號染色體的2條染色體單體(其中F1為父親攜帶的13號與14號發(fā)生了羅氏易位的衍生染色體)，M1、M2為母親樣本13號染色體的2條染色體單體。1號胚胎7號染色體有26.12 Mb的缺失且遺傳了父親的羅氏易位衍生染色體為羅氏易位攜帶胚胎；2號胚胎14號染色體有82.99 Mb的缺失且為染色體不平衡胚胎；3號胚胎染色體數(shù)目正常且沒有遺傳到父親的羅氏易位衍生染色體，為正常胚胎；4號胚胎染色體數(shù)目正常且遺傳了父親樣本的羅氏易位衍生染色體，為羅氏易位攜帶胚胎。

2.213、14號染色體單體型構(gòu)建結(jié)果 父、母親與4個受檢胚胎13、14號染色體單體型構(gòu)建的結(jié)果見表2、3。遺傳了羅氏易位衍生染色體F1的1號胚胎13號染色體上20個SNP位點與14號染色體上28個SNP位點信息與父親樣本的F1染色體相同；而同樣遺傳了羅氏易位衍生染色體F1的4號胚胎13號染色體上20個SNP位點與14號染色體上27個SNP位點信息與父親樣本的F1染色體相同；說明1、4號胚胎的羅氏易位衍生染色體確實來源于父親。2號胚胎14號染色體只有1條染色單體，為染色體缺失；3號胚胎13號與14號染色體則遺傳了父母雙方的正常染色單體。

表1 4個胚胎的NGS結(jié)果匯總

表2 13號染色體單體型構(gòu)建結(jié)果

續(xù)表2 13號染色體單體型構(gòu)建結(jié)果

注：S17081801-F表示父親樣本；S17081801-M表示母親樣本；S17081801-1表示1號受檢胚胎；S17081801-2表示2號受檢胚胎；S17081801-3表示3號受檢胚胎；S17081801-4表示4號受檢胚胎；SNP_1～SNP_20表示受檢樣本13號染色體上的1號SNP位點到20號SNP位點；“：”和“|”分別表示父母樣本和子代樣本同一條染色體相鄰2個SNP的分隔符，均起到區(qū)分作用；“？”表示未知的結(jié)果或者是檢測到SND但無法確定

表3 14號染色體單體型構(gòu)建結(jié)

注：S17081801-F表示父親樣本；S17081801-M表示母親樣本；S17081801-1表示1號受檢胚胎；S17081801-2表示2號受檢胚胎；S17081801-3表示3號受檢胚胎；S17081801-4表示4號受檢胚胎；SNP_1～SNP_20表示受檢樣本14號染色體上的1號SNP位點到20號SNP位點；“：”和“|”分別表示父母樣本和子代樣本同一條染色體相鄰兩個SNP的分隔符，均起到區(qū)分作用；“？”表示未知的結(jié)果或者是檢測到SND但無法確定

3 討 論

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測是在體外受精-胚胎移植基礎(chǔ)上對卵母細(xì)胞或種植前胚胎進(jìn)行活檢，利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行檢測，選擇正?；蜻z傳表型正常的胚胎移植，從而有效降低流產(chǎn)率，提高活產(chǎn)率，避免選擇性終止妊娠。

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測主要包括PGS和PGD 2個方面，PGS是對胚胎23對染色體非整倍體異常、微缺失、微重復(fù)異常進(jìn)行篩查，選擇沒有發(fā)生染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的胚胎進(jìn)行移植，有效降低早期流產(chǎn)風(fēng)險，顯著提高臨床妊娠率。PGD是針對不同的病因在胚胎著床之前即對配子或胚胎進(jìn)行遺傳物質(zhì)分析，選擇沒有發(fā)生染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的胚胎進(jìn)行移植，可有效阻斷家族遺傳病的垂直遺傳。

對染色體羅氏易位攜帶者進(jìn)行PGD檢測，目前已被報道的檢測技術(shù)主要包括熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、微陣列比較基因組雜交(aCGH)及NGS，這些檢測技術(shù)均在對染色體易位的檢測中發(fā)揮了重要作用，各有優(yōu)勢，同時，也均具有一定的局限性。

FISH技術(shù)曾是PGD主要的遺傳學(xué)方法之一，用以篩查染色體臂間倒位及易位，判定是否存在嵌合以及染色體異常[7]。其局限性主要表現(xiàn)在由于探針數(shù)量或染料種類的限制，F(xiàn)ISH技術(shù)無法全面檢測23對染色體[8]；2012、2013年波蘭學(xué)者LUKASZUK博士分別利用FISH技術(shù)和NGS作為技術(shù)手段對一對男方攜帶有14、15號染色體羅氏易位衍生染色體的夫婦進(jìn)行PGD檢測輔助生殖，2012年1月進(jìn)行FISH檢測挑選后移植，但由于FISH技術(shù)無法對染色體數(shù)目進(jìn)行全面篩查，所植入胚胎在第10個孕周時流產(chǎn)；2013年9月該團(tuán)隊取樣10枚囊胚期胚胎細(xì)胞，采用與本研究同樣的NGS檢測技術(shù)，經(jīng)全基因組擴增利用Ion PGM測序儀及其配套NGS試劑進(jìn)行測序，根據(jù)分析結(jié)果挑選1枚健康胚胎移植，成功輔助夫婦誕下一名健康嬰兒[9]。說明了NGS技術(shù)可實現(xiàn)檢測胚胎是否攜帶羅氏易位衍生染色體的同時還對染色體是否發(fā)生了非整倍體數(shù)目異常進(jìn)行檢測，首先排除會造成流產(chǎn)或先天性出生缺陷的染色體數(shù)目異常胚胎，實現(xiàn)更加全面的遺傳學(xué)檢測。

aCGH技術(shù)是與FISH相關(guān)、能篩查出胚胎染色體數(shù)目異常的檢測技術(shù)，但aCGH與本研究中應(yīng)用的NGS在篩查染色體數(shù)目異常的準(zhǔn)確率方面存在差異，2015年YANG等[10]采用NGS技術(shù)進(jìn)行了79例植入前遺傳學(xué)檢測，采用aCGH進(jìn)行了78例植入前遺傳學(xué)檢測，采用NGS檢測的流產(chǎn)率為1.3%，采用aCGH檢測的流產(chǎn)率為2.6%；2016年NISSON等[11]將NGS和aCGH進(jìn)行了對比研究，結(jié)果顯示，NGS準(zhǔn)確率為95%，aCGH準(zhǔn)確率為87%。故相對于FISH，本研究采用的達(dá)瑞生殖基于Ion PGM測序儀在胚胎活檢后進(jìn)行NGS的檢測方法在羅氏易位攜帶者檢測方面在實現(xiàn)更加全面的檢測同時在染色體數(shù)目異常檢測的準(zhǔn)確率方面優(yōu)于aCGH技術(shù)，且通過一個配套的實驗流程，使用同一套儀器設(shè)備能同時達(dá)到染色體數(shù)目篩查和羅氏易位衍生染色體檢測的目的，讓PGD檢測更加全面、精確和便捷。

作為新型羅氏易位攜帶者PGD檢測技術(shù)，NGS本身也具有一定的局限性，如因單細(xì)胞全基因組擴增(WGA)過程中可能存在的等位基因脫扣有可能造成誤診或漏診[12]。而本研究在NGS的數(shù)據(jù)分析中結(jié)合了核型分析的結(jié)果在13號染色體區(qū)域選了20個SNP位點、14號染色體區(qū)域上選取了28個SNP位點進(jìn)行家系單體型構(gòu)建，再通過SNP連鎖分析構(gòu)建4號受檢胚胎13、14號染色體的單體型，有效避免了等位基因脫扣對檢測結(jié)果判讀的影響；而在2017年XU等[13]采用同樣基于NGS檢測技術(shù)的等位基因映射識別攜帶者單體型技術(shù)對3對羅氏易位攜帶者夫婦的12例胚胎先后進(jìn)行羅氏易位攜帶者PGD檢測與分析，對特定區(qū)域選取了6個SNP位點進(jìn)行連鎖分析來構(gòu)建單體型，其中2對夫婦各獲得1個健康胚胎，進(jìn)行植入后其中一對夫婦已成功誕下健康嬰兒，另一對夫婦成功得到妊娠，羊水穿刺顯示核型分析正常。與2017年XU等[13]研究結(jié)果比較，本研究在特定區(qū)域選取了更多的SNP位點進(jìn)行連鎖分析，能更好地避免等位基因脫扣造成誤診的問題，令胚胎染色體單體型構(gòu)建可信度更高。

本研究采用WGA結(jié)合NGS和SNP連鎖分析，通過單體型的構(gòu)建可推斷胚胎2條DNA鏈的來源，從而最終確定其是否為正常胚胎。根據(jù)本研究4個胚胎的檢測結(jié)果，1、2號胚胎均存在染色體異常，經(jīng)構(gòu)建13、14號染色體單體型，進(jìn)一步進(jìn)行PGD檢測，鑒定1、4號胚胎均為羅氏易位攜帶者。由于羅氏易位衍生染色體攜帶者在表型上和正常核型的人并無差異[14]，往往因為其子女患有某種疾病而確診[15]，沒有發(fā)生染色體數(shù)目變異的3、4號胚胎均為可正常出生和發(fā)育成長的可移植胚胎；但羅氏易位攜帶者在生育時存在較高風(fēng)險生出染色體異常的后代，3號胚胎由于沒有攜帶羅氏易位衍生染色體，故為優(yōu)質(zhì)胚胎。最后選擇核型正常且沒有致病基因攜帶的3號胚胎進(jìn)行植入，阻斷了羅氏易位衍生染色體的垂直遺傳，有利于優(yōu)生優(yōu)育。

目前，國內(nèi)外均可見到NGS用于PGS/PGD的文獻(xiàn)報道，但由于當(dāng)下PGS、PGD需對胚胎細(xì)胞進(jìn)行活檢取樣，這個過程對胚胎本身的損傷也備受爭議。近年來，對PGS和PGD的部分文獻(xiàn)還報道了其存在子代安全性[16]及后天發(fā)育的問題[17]，但目前缺乏這方面的樣本積累及研究。近年來，無創(chuàng)胚胎染色體篩查技術(shù)已興起，該技術(shù)應(yīng)用游離在胚胎培養(yǎng)液中的微量DNA通過單細(xì)胞全基因擴增技術(shù)實現(xiàn)對胚胎染色體的全面篩查[18]，將從胚胎上提取細(xì)胞的活檢形式改成從培養(yǎng)液中提取DNA，保留了胚胎樣本的完整性。相信隨著科技的進(jìn)步，PGS和PGD會用于各種生殖遺傳疾病方面的檢測，對羅氏易位攜帶者的PGD技術(shù)會越來越成熟和可靠。