朱永群，彭丹丹，彭 燕，張新全，陳仕勇，許文志，姚 莉，王 謝，林超文

（1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川 成都 611130；3. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

蘇丹草(Sorghum sudanense)為禾本科高梁屬一年生草本植物，因具有分蘗能力強(qiáng)、再生性好、營養(yǎng)價值高和適口性好等優(yōu)點，可多次刈割青飼或青貯，也可用于調(diào)制干草利用[1]，已成為許多國家及我國干旱和半干旱地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的重要飼料作物，也是南方地區(qū)“糧改飼”種植模式的優(yōu)選牧草之一。高丹草 (S. bicolor×S. sudanense)為蘇丹草與高粱種間雜交產(chǎn)生的雜種類型(2n=2x=20)，屬于高光效C4植物[2]，因綜合了親本高粱的莖粗、葉寬與蘇丹草的分蘗及再生能力強(qiáng)等特性而具有明顯的雜種優(yōu)勢，目前在我國東北、西北、華北以及長江以南地區(qū)都有廣泛的種植，甚至可替代蘇丹草使用。高丹草性喜溫暖濕潤氣候，雖其本身具有一定的耐旱性，但干旱作為主要的逆境因子之一，嚴(yán)重影響了種子萌發(fā)與幼苗階段對環(huán)境的適應(yīng)能力，從而對其后期的生長發(fā)育和產(chǎn)量具有直接或間接的影響[3-4]。因此開展幼苗期耐旱種質(zhì)的篩選和鑒定對優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的蘇丹草及高丹草的推廣與應(yīng)用具有重要的意義。

目前，已建立了多種方法應(yīng)用于作物的抗旱性評價，常用方法包括田間直接鑒定法、旱棚或人工氣候室法、盆栽鑒定法和間接鑒定法等，由于前3種方法普遍存在試驗周期長和易受環(huán)境影響等缺點，而通過形態(tài)學(xué)指標(biāo)、產(chǎn)量指標(biāo)以及生理生化指標(biāo)間接評價和鑒定作物的抗旱性具有簡單、快速和準(zhǔn)確的特點，在加速植物抗旱鑒定和抗旱育種進(jìn)程中具有重要的意義[5]。趙娜等[6]通過測定細(xì)胞膜相對透性、游離脯氨酸(Pro)含量及供試材料在干旱和復(fù)水過程中莖稈倒伏和葉片萎蔫等表觀生長狀況的變化共3項生理指標(biāo)對6份高丹草品種進(jìn)行了抗旱性評價。桂枝等[1]通過測定生長早期幼苗的存活率、相對株高和地上部鮮重3項指標(biāo)對22份蘇丹草材料進(jìn)行耐旱性評價，研究發(fā)現(xiàn)幼苗存活率和地上部干質(zhì)量與蘇丹草生長早期的抗旱性具有顯著的相關(guān)性。李源等[7]根據(jù)全生育期的生長性狀、產(chǎn)量以及牧草品質(zhì)等指標(biāo)對5份高丹草品種進(jìn)行抗旱性研究，結(jié)果表明不同指標(biāo)對應(yīng)的各品種抗旱性順序存在一定的差異。Bibi等[8]以水勢、滲透勢、葉片膨壓、氣孔導(dǎo)度、根長和莖長6項指標(biāo)為依據(jù)對10份蘇丹草材料進(jìn)行了抗旱性評價。這些研究大多是通過干旱脅迫下不同指標(biāo)值的大小來評價蘇丹草、高丹草的抗旱性。而植物抗旱是一個極其復(fù)雜的生理過程，簡單的比較某一指標(biāo)或某幾個指標(biāo)值的大小難以反映植物的真實抗旱水平。隸屬函數(shù)分析法則提供了一條在多指標(biāo)測定基礎(chǔ)上對材料抗旱特性進(jìn)行綜合評價的途徑，近年來已廣泛應(yīng)用于多種植物的抗旱性評定[9-12]，但迄今為止應(yīng)用于蘇丹草和高丹草等禾本科牧草的抗旱性篩選和評價還少有報道。

本研究以蘇丹草和高丹草共12份材料為研究對象，對干旱脅迫下幼苗期葉片相對含水量、電導(dǎo)率、丙二醛含量、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒?Fv/Fm)、凈光合速率和水分利用效率等生理生化指標(biāo)進(jìn)行分析，并應(yīng)用隸屬函數(shù)法根據(jù)各指標(biāo)隸屬值的平均值大小對材料的抗旱性進(jìn)行綜合評價，為蘇丹草及高丹草抗旱新品種選育和優(yōu)質(zhì)牧草的栽培提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究選用農(nóng)業(yè)部全國畜牧總站國家牧草種質(zhì)基因庫提供的8份蘇丹草材料和1份高丹草材料(編號為1-9)，以及四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所已有的3份材料(其中1份為蘇丹草，其余2份為育成的新品種高丹草材料)，共12份，材料詳情如表1所列。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2017年9月至12月在四川省農(nóng)科院土壤肥料研究所土壤與耕作飼草實驗室內(nèi)進(jìn)行，采用沙培法對種子幼苗進(jìn)行培育。種子經(jīng)1%次氯酸鈉消毒5 min后用蒸餾水潤洗幾次，選取100粒均一的種子均勻播撒在盛有石英砂的塑料育苗盆(長20 cm，寬 13 cm，高 8 cm)中，于 24 ℃ 光照培養(yǎng)箱內(nèi)萌發(fā)，溫度設(shè)置為白天26 ℃，夜晚22 ℃，時長各為12 h，濕度為65%。待種子出苗后更換為Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)，每2 d更換一次營養(yǎng)液，待幼苗長至20 d左右(第3片成熟葉片完全展開)，選取長勢一致的材料用滲透勢為-0.4 MPa含PEG-6000的Hoagland全營養(yǎng)液進(jìn)行為期6 d的干旱脅迫處理，對照組(CK)采用Hoagland全營養(yǎng)液進(jìn)行正常培養(yǎng)。試驗設(shè)置3次重復(fù)，于干旱脅迫6 d(基于前期預(yù)試驗得知該時間點植株表型性狀差異最為明顯)分別對CK和處理組進(jìn)行取樣并測定相關(guān)生理指標(biāo)。

表1 供試材料詳情Table 1 Plant materials for this study

1.3 測定指標(biāo)及方法

葉綠素?zé)晒?Fv/Fm)采用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x (MINI-PAM-II, Heinz WALz, NH, Germany)于黑暗條件下測定，測定前將材料置于避光環(huán)境下1.5 h進(jìn)行暗適應(yīng)處理。植物葉片凈光合速率(Pn)和蒸騰速率(Tr)使用便攜式光合測定儀(LI-6400, LICOR Inc.,Lincoln, NE, USA)，測定條件的光合有效輻射 (PAR)、溫度和 CO2濃度分別設(shè)定為 1 200 μmol·(m2·s)-1、23 ℃和 400 μmol·L-1。測量時間從 10:30開始，每份材料隨機(jī)選取10個葉片進(jìn)行測定[13]。水分利用效率(WUE)根據(jù)公式WUE=Pn/Tr計算。

葉片相對含水量 (relative water content, RWC)采用烘干法，根據(jù)公式RWC=(鮮重-干重) / (飽和鮮重-干重) × 100% 計算[14]；電解質(zhì)滲透率 (electrolyte leakage,EL)使用電解質(zhì)滲透儀根據(jù)煮前電導(dǎo)率與煮后電導(dǎo)率的百分比計算[15]；葉綠素含量(chlorophyll content)采用乙醇-丙酮浸提法測定[16]。

丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定前需進(jìn)行粗酶液的提取。即0.1 g鮮葉片經(jīng)液氮速凍并用組織研磨機(jī)搗碎，再加入1.5 mL預(yù)冷的含1%聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)的磷酸緩沖溶液 (150 mmol·L-1，pH 7.0)充分冰浴研磨，4 ℃ 下 15 000 r·min-1離心 20 min，上清液即為粗酶提取液于冰浴中待測。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[17]；

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用模糊隸屬函數(shù)值法，分別求出12份材料各項指標(biāo)的具體抗旱隸屬值，再對每份材料各項指標(biāo)的隸屬值進(jìn)行累加求出平均值，即得出平均抗旱隸屬值，對材料的抗旱性進(jìn)行綜合評價。平均抗旱隸屬值越大，則材料的抗旱性越強(qiáng)。

所測指標(biāo)與抗旱性呈正相關(guān)關(guān)系，計算公式：Xij=(X-Xmin) / (Xmax-Xmin)；與抗旱性呈負(fù)相關(guān)，計算公式則為Xij= 1-(X-Xmin) / (Xmax-Xmin)。式中:Xij表示i材料j指標(biāo)的抗旱隸屬函數(shù)值，X表示i材料j指標(biāo)的測定值，Xmax和Xmin分別表示所有材料在某一指標(biāo)測定值內(nèi)的最大和最小值[9, 18]。

采用Excel 2006進(jìn)行繪圖與數(shù)據(jù)處理；SAS 8.0軟件對相對含水量，相對電導(dǎo)率、丙二醛、葉綠素含量等指標(biāo)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(P＜ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對蘇丹草及高丹草幼苗葉片相對含水量的影響

相對含水量(RWC)的變化直觀地反映了植物在逆境脅迫下體內(nèi)水分的虧缺程度。正常條件下葉片相對含水量維持在96%左右，干旱脅迫使得葉片相對含水量較 CK 顯著降低 (P＜ 0.05)(圖1)，但因材料不同下降幅度各有差異。其中受干旱脅迫影響較小的為1、2、3和12號(‘海獅’)蘇丹草以及11號‘蜀草1號’高丹草，與CK相比分別降低了50.64%、54.58%、55.27%、54.23%和54.0%；而7號和8號蘇丹草以及9號高丹草的葉片相對含水量受干旱脅迫影響則較顯著，分別較其對照降低了67.54%、69.33%和73.66%。

圖1 干旱脅迫對供試材料葉片相對含水量的影響Figure 1 Effect of drought stress on relative water content in the leaves of the different materials

2.2 干旱脅迫對蘇丹草及高丹草幼苗相對電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響

圖2 干旱脅迫對供試材料相對電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響Figure 2 Effect of drought stress on electrolyte leakage and malondialdehyde content in the leaves of the different materials

干旱脅迫使得葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量顯著增高(P＜ 0.05)，但不同材料增長幅度各異(圖2)，干旱脅迫下2和12號(‘海獅’)蘇丹草及10(‘蜀草2號’)和11號(‘蜀草1號’)高丹草的葉片相對電導(dǎo)率分別比CK增高了74.74%、69.28%、和65.99%、80.73%，增長幅度較小；而7號、8號兩份蘇丹草以及9號高丹草的增長幅度為最高，分別較CK增高了123.5%、112.33%和118.0%。

干旱脅迫下葉片MDA含量的增長趨勢同電導(dǎo)率類似，增長幅度較小的為3號和12號(‘海獅’)蘇丹草以及10(‘蜀草 2號’)和 11號 (‘蜀草 1號’)兩份高丹草，分別較其CK增高了283.27%、266.39%和188.46%、239.62%，而增幅較大者為6號和8號兩份蘇丹草及9號高丹草，分別較CK增長了392.93%、431.01% 和 421.35%(圖2)。

2.3 干旱脅迫對蘇丹草及高丹草幼苗葉綠素含量的影響

干旱脅迫下葉綠素含量顯著降低(P＜ 0.05)。與各自的對照相比，干旱脅迫使得12份材料的葉綠素含量分別降低了63.38%、60.82%、56.05%、56.90%、60.67%、61.58%、64.99%、62.77%、85.70%、64.15%、61.74%和61.29%，可知下降幅度較小的材料為3和4號蘇丹草，下降幅度最大的為9號高丹草材料(圖3)。

2.4 干旱脅迫對蘇丹草和高丹草幼苗光合作用參數(shù)的影響

干旱脅迫引起植物光化學(xué)活性顯著降低(P＜ 0.05)。干旱脅迫下12份材料最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)分別較對照下降了20.95%、20.92%、22.88%、19.92%、25.02%、33.40%、37.30%、47.13%、60.02%、25.80%、19.59%和27.0%，可知降低幅度較小的為3份蘇丹草材料[1、2和4號(‘烏拉特1號’ )]以及11號‘蜀草1號’高丹草材料，降低幅度較大的為7號和8號蘇丹草及9號高丹草材料(圖4)。

圖3 干旱脅迫對供試材料葉綠素含量的影響Figure 3 Effect of drought stress on chlorophyll content in the leaves of the different materials

干旱脅迫抑制光合反應(yīng)途徑的進(jìn)行，導(dǎo)致凈光合速率和水分利用率均顯著降低(P＜ 0.05)(圖4)。與對照相比，干旱脅迫下12份材料的凈光合速率依次降低了 21.03%、24.83%、14.70%、19.74%、17.84%、25.23%、40.96%、34.50%、41.24%、13.32%、21.25%和15.85%，水分利用效率依次降低了31.27%、30.30%、27.62%、25.10%、23.56%、39.24%、58.00%、58.39%、60.81%、26.87%、27.53%和31.15%，兩項指標(biāo)下降幅度較大的均為7和8兩份蘇丹草及9號高丹草材料，降低幅度最小的為3、4、5和12號(‘海獅’)4份蘇丹草以及10號‘蜀草2號’高丹草材料。

圖4 干旱脅迫對供試材料光合作用參數(shù)的影響Figure 4 Effect of drought stress on photosynthetic parameters of the different materials

2.5 隸屬函數(shù)法對蘇丹草及高丹草材料耐旱性的綜合評價

根據(jù)12份供試材料的7項指標(biāo)計算抗旱隸屬函數(shù)平均值得出綜合排名(表2)，材料編號1、2、3蘇丹草和11號‘蜀草1號’高丹草的隸屬函數(shù)平均值分別為0.89、0.85、0.87和0.98，綜合排序列于前 4名；4(‘烏拉特 1號’)、5和 12(‘海獅’)蘇丹草及10號‘蜀草2號’高丹草次之，隸屬函數(shù)平均值介于0.7～0.8，綜合排名居于5～8位；9號高丹草所有指標(biāo)的測定值在各項指標(biāo)內(nèi)均為最小，其抗旱隸屬值計算結(jié)果為“0”，因而排名最后。

3 討論與結(jié)論

植物的抗旱性與體內(nèi)的水分含量密切相關(guān)，其不僅反映了在缺水環(huán)境下植物因蒸騰作用耗水機(jī)體組織的運水和恢復(fù)能力，還指示了植物的保水性能，因而相對含水量被認(rèn)為是鑒定植物抗旱性的綜合有效指標(biāo)之一[19]。同時植物在干旱環(huán)境下機(jī)體因缺水會迅速積累大量的活性氧(ROS，如O2-、H2O2、·OH和1O2等)，生成強(qiáng)氧化性的脂質(zhì)過氧化物和小分子降解物，引發(fā)和加劇膜脂過氧化程度，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性遭到破壞，MDA作為膜脂過氧化產(chǎn)物之一，通常和電解質(zhì)滲透率一起作為衡量細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損程度的重要指標(biāo)[20-21]。因而相對含水量與MDA和相對電導(dǎo)率在衡量植物的抗旱性過程中負(fù)相關(guān)。植物受干旱脅迫的影響程度越大，電解質(zhì)滲透率和MDA含量越高，抗旱能力則越弱[3, 22]，而抗旱性較強(qiáng)的植物則能維持較高的相對含水量和相對較低的相對電導(dǎo)率及MDA含量[23-24]。本研究結(jié)果也剛好印證了這一點，干旱脅迫下供試材料相對含水量的變化與相對電導(dǎo)率和MDA含量的變化正好相反，材料2、3和12號(‘海獅’)蘇丹草以及兩份高丹草 10(‘蜀草 2號’)和 11(‘蜀草1號’)的RWC受干旱脅迫降幅較低，MDA含量和相對電導(dǎo)率升高的較少，說明該5份材料在干旱脅迫下具有較好的維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和相對穩(wěn)定的特性以及較強(qiáng)的保水性能，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。而7、8號蘇丹草以及9號高丹草則與之相反，因而受干旱脅迫的影響最大，其抗旱性則弱。

植物光合作用的實現(xiàn)依賴于葉綠素對光能的吸收，干旱脅迫下葉綠素含量降低可能一方面源于葉綠素的生物合成減弱，另一方面可能為植物體內(nèi)活性氧的積累引起膜脂過氧化加速了葉綠素的分解[25]。因而干旱脅迫下葉綠素含量的變化不僅可用來指示植物對干旱脅迫的敏感性，還可在一定程度上反映植物的生產(chǎn)性能和受干旱脅迫的影響程度[26]。葉綠素含量隨著干旱脅迫程度的加劇而降低，而抗旱性強(qiáng)的品種(系)具有維持較高葉綠素含量的能力，這與其他牧草和作物的研究結(jié)果相一致[25, 27-28]。迄今為止將葉綠素含量的變化應(yīng)用于植物抗旱性評價較少，且在高粱屬植物的抗旱性評價中還未曾應(yīng)用過此項指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，干旱脅迫導(dǎo)致葉綠素含量顯著降低，但抗旱性強(qiáng)的材料葉綠素含量降幅較小。

表2 12份供試材料各指標(biāo)隸屬函數(shù)值及耐旱性綜合評價Table 2 Subordinate function and comprehensive identification of drought resistance capacity of 12 cultivars

植物在脅迫環(huán)境下光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心光化學(xué)活性的降低主要體現(xiàn)在PSⅡ電子傳遞速率的降低。研究表明，PSⅡ光化學(xué)效率(Fv/Fm)是指示植物受光抑制和逆境脅迫程度的探針[29]，近年來已運用于小麥(Triticum aestivum)[30]、蘇丹草和高丹草[31]等多種作物的抗旱評價中。眾所周知光合作用是植物生長的物質(zhì)基礎(chǔ)，其強(qiáng)弱決定了牧草最終的品質(zhì)和產(chǎn)量。干旱脅迫影響植物葉綠體光化學(xué)反應(yīng)特性和光合途徑的正常運行，導(dǎo)致光合速率降低，且隨著干旱脅迫程度的加劇，凈光合速率下降幅度增大，付芳婧等[32]在玉米(Zea mays)的抗旱性評價中研究發(fā)現(xiàn)葉片凈光合速率的抗旱指數(shù)與抗旱隸屬度呈正相關(guān)關(guān)系，鄔爽等[33]的研究表明，水分脅迫下抗旱性強(qiáng)的小麥品種能維持較的高凈光合速率和水分利用效率。本研究結(jié)果表明，12份供試材料葉綠素?zé)晒?Fv/Fm)、凈光合速率和水分利用效率受干旱脅迫的影響均顯著降低，其中編號7、8的蘇丹草和9號高丹草該指標(biāo)的下降幅度較為一致且較為明顯，說明其在干旱脅迫下光合性能較弱，而材料編號1、2、3、4號(‘烏拉特1號’)蘇丹草與 10(‘蜀草 2號’)和 11(‘蜀草 1號’)高丹草以及12(‘海獅’)蘇丹草共7份材料總體的光合作用參數(shù)降幅較低，說明其在干旱脅迫下能維持較強(qiáng)的光合性能，因而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。胡舉偉等[31]在比較高丹草與蘇丹草兩種牧草葉片PSⅡ光化學(xué)活性的抗旱優(yōu)勢研究中表明，干旱脅迫下高丹草具有更好地維持PSⅡ光化學(xué)活性的特性；另也有關(guān)于高粱蘇丹草雜交種在干旱脅迫下光合機(jī)能明顯優(yōu)于親本蘇丹草的報道[34]。而本研究中并非所有高丹草的光合性能都優(yōu)于蘇丹草，與先前報道略有出入，其原因可能是先前的試驗選材存在一定的局限性，以及本研究因供試材料親本關(guān)系不詳不具有可比性。

植物抗旱反應(yīng)涉及多個生理生化方面的過程，不同品種(系)的某一具體指標(biāo)對干旱脅迫的反應(yīng)不一定相同，不同指標(biāo)之間還存在著顯著的相關(guān)性[35]。綜合試驗結(jié)果來看，雖然相同抗旱類別的材料總體上各項生理生化指標(biāo)受干旱脅迫的影響變化較為一致，但依據(jù)單一指標(biāo)對材料的抗旱性排序又不盡相同，說明以單一指標(biāo)評價植物的抗旱性強(qiáng)弱具有一定的局限性和片面性，因而本研究根據(jù)供試材料的各項生理生化指標(biāo)采用隸屬函數(shù)加權(quán)平均法對材料的抗旱性進(jìn)行綜合評價，消除了個別指標(biāo)帶來的片面性，使參試材料的抗旱差異具有可比性，從而提高了材料抗旱鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。鑒定結(jié)果為材料編號為1、2、3的蘇丹草和 10(‘蜀草 2號’)、11(‘蜀草 1號’高丹草)、12(‘海獅’蘇丹草)抗旱性較強(qiáng)，編號為7、8的兩份蘇丹草和9號高丹草抗旱性較弱。

綜上所述，本研究雖初步得出了12份供試蘇丹草及高丹草的抗性比較結(jié)果，但植物的抗旱性評定僅依據(jù)實驗室內(nèi)的生理生化指標(biāo)存在一定的局限性，可進(jìn)一步借助田間多年多點試驗結(jié)合植物形態(tài)指標(biāo)和產(chǎn)量指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，以期篩選出抗旱性強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的牧草材料。