張同剛，李亞蕾，羅瑞明*，馬夢斌，周亞玲

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

線粒體是真核生物中生成生命所需能量的細胞器[1-5]，在正常的動物體內(nèi)，肌紅蛋白將氧氣運送到線粒體中進行有氧呼吸作用[6-8]。動物宰后生命雖然結(jié)束，但胴體中的線粒體不會立刻停止活動，會繼續(xù)進行一系列的氧化代謝反應(yīng)[9-13]。曹錦軒等[14]研究了貯藏期間線粒體的損傷情況，得出線粒體結(jié)構(gòu)與功能均隨著貯藏時間的延長而遭到不同程度的損傷。透射電子顯微鏡可以對細胞及亞細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行形態(tài)學(xué)觀察[15-16]，原子力顯微鏡可以用來對細胞及亞細胞的外部結(jié)構(gòu)進行形態(tài)學(xué)掃描[17-20]。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對影響肉色及其穩(wěn)定性的內(nèi)外部因素進行了大量研究[21-23]，但涉及到冷鮮牛肉貯藏過程中肌細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化與色澤變化相關(guān)性的研究較少。本實驗研究了宰后牛肉4 ℃真空包裝貯藏21 d，線粒體功能和結(jié)構(gòu)變化對肉色的影響，從細胞學(xué)層面揭示了牛肉貯藏過程中肉色變化的微觀機理，對開發(fā)牛肉貯藏過程中護色、保鮮技術(shù)和延長牛肉及其產(chǎn)品的貨架期，具有理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛肉購于寧夏鹽池縣大夏牧場肉食品有限公司。

線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒、線粒體提取試劑盒、ATP檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成生物技術(shù)股份有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1200紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；960MC型熒光分光光度計 上海精密儀器有限公司；Oxytherm氧電極 英國Hansatech公司；Optima L-100XP高速冷凍離心機 美國Beckman公司；HT 7700透射電子顯微鏡 日本日立公司；Nanoscope V原子力顯微鏡 美國Bruker公司；LB-QM6手持式ATP熒光檢測儀 青島路博偉業(yè)環(huán)?？萍加邢薰尽?/p>

1.3 方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

牛胴體修整后，取雙側(cè)背最長肌，為盡可能減少其他因素對肉色變化的干擾，迅速去除殘血、多余脂肪與結(jié)締組織等，無菌生理鹽水沖洗后，將肉樣分成200 g左右肉塊，4 ℃真空包裝避光保藏21 d。以宰后當(dāng)天作為第0天，每隔3 d取樣進行指標測定。

1.3.2 肌紅蛋白含量測定

肌紅蛋白（m y o g l o b i n，M b）含量的測定參照Krzywicki[24]的方法，取待測5 g肉樣，加入25 mL 0.04 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8），在室溫下用勻漿器均質(zhì)（10 000 r/min、25 s，4 ℃）。靜置60 min后，離心（4 500hg、4 ℃，20 min）。將上清液過濾，然后，采用紫外-可見分光光度計分別在525、545、565 nm和572 nm波長處測量其吸光度。Mb濃度及脫氧肌紅蛋白（deomyoglobin，DeoMb）、氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，MbO2）與高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）相對含量分別按式（1）～（4）進行計算。

式中：R1、R2、R3分別為吸光度比值A(chǔ)572nm/A525nm、A565 nm/A525 nm、A545 nm/A525 nm。

1.3.3 牛骨骼肌線粒體的提取及指標測定

取10 g肉羊，用生理鹽水洗凈血水，線粒體的提取按照線粒體提取試劑盒說明書要求操作，以上過程均在4 ℃條件下完成。

1.3.3.1 線粒體耗氧量測定

首先將氧電極定標后，在反應(yīng)杯中加入1.5 mL反應(yīng)介質(zhì)（含1 mmol/L蔗糖、10 mmol/L Tris、10 mmol/L乙二胺四乙酸、10 mmol/L磷酸二氫鉀，pH 7.4）和0.5 mL 0.5 mg/mL線粒體懸浮液，待穩(wěn)定后此時曲線即為I態(tài)呼吸曲線；加入0.2 mL琥珀酸鈉（10 mmol/L），待穩(wěn)定后所得曲線為II態(tài)呼吸曲線；加入0.5 mL ADP（0.05 mmol/L）后，此時的曲線即為III態(tài)呼吸曲線；待ADP消耗后，曲線斜率大幅下降，所得曲線即為IV態(tài)呼吸曲線。使用oxygraph軟件測量曲線斜率，線粒體呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）按公式（5）[25]進行計算。

式中：ST3、ST4分別表示線粒體III態(tài)呼吸和ADP耗盡后線粒體IV態(tài)呼吸的耗氧量/（mmol/（mingmg））。

1.3.3.2 MMP測定

提取線粒體后用Mito Solution重懸線粒體沉淀，按照MMP檢測試劑盒說明書要求操作。將0.9 mL試劑盒染色液加入到0.5 mg線粒體懸浮液中，避光37 ℃水浴20 min后，測定紅色熒光（發(fā)射波長為590 nm、激發(fā)波長為525 nm）和綠色熒光（發(fā)射波長為530 nm、激發(fā)波長為490 nm）的強度，二者的比值即為MMP。

1.3.3.3 線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔開放狀態(tài)檢測

骨骼肌離體線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放狀態(tài)檢測參考彭艷艷等[26]的方法，并略作修改。將線粒體懸液加入到96 孔板中，再加入GENMED緩沖液（Reagent A，170 μL），混合均勻，在波長540 nm處采用酶標儀測量OD值，OD值越大，表明MPTP開放越大。

1.3.3.4 ATP含量測定

采用ATP測定試劑盒測定ATP含量。將ATP測定試劑平衡至室溫后，取100 μL樣品加入96 孔白板上，再加入新鮮提取的線粒體懸浮液50 μg，振蕩30 s靜置5 min立即用手持ATP熒光檢測儀檢測。

1.3.3.5 SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量檢測

根據(jù)SOD檢測試劑盒、GSH-Px檢測試劑盒、CAT檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒說明書操作，分別檢測SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量。

1.3.3.6 對線粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)進行透射電子顯微鏡檢測

將線粒體懸浮液離心（8 000hg，15 min），使肌細胞線粒體沉降，然后取截面為1 mm的沉淀，用體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液固定過夜；磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2）漂洗4～5 次，每次15 min，之后用鋨酸固定2 h；PBS（pH 7.2）漂洗5～6 次，每次15 min；用體積分數(shù)30%、50%、70%、80%乙醇溶液分別脫水15～30 min，然后依次90%乙醇脫水30 min、100%乙醇3 次30 min脫水和2 次純丙酮30 min脫水；用膠水（601膠水，下同）置換丙酮，分別用V（膠水）∶V（丙酮）＝1∶3進行2 h、V（膠水）∶V（丙酮）＝1∶1進行4 h、V（膠水）∶V（丙酮）＝1∶3進行12 h、純膠進行24 h；每個模具中先加入1 滴膠水，順向放入一條線粒體塊，再滴膠水使模具表面膠水略突出一點。放入30 ℃烘箱靜置24 h，后調(diào)整溫度至60 ℃，48 h烘干；取出樣品塊，用刀片修樣、切片、染色，之后上機觀察。

1.3.3.7 原子力顯微鏡檢測線粒體外部形態(tài)結(jié)構(gòu)

線粒體保存液中含有大量蔗糖，因此黏度較大，且容易有各類離子結(jié)晶干擾；所以實驗前要將多余雜質(zhì)清洗除去，防止干擾。首先將線粒體懸液滴加在處理后的潔凈云母片上，直徑不超過1 cm，放入4 ℃冰箱隔夜晾干，上鏡檢測，掃描范圍20 μm。

1.3.3.8 線粒體損傷評分

觀察透射電子顯微鏡（×5 000倍）下的線粒體數(shù)量并進行損傷評分，損傷評分的標準參照flameng分級，分為5 個等級，即0～4級，分別代表0～4 分；其中，0級表示線粒體的結(jié)構(gòu)正常；1級表示線粒體結(jié)構(gòu)內(nèi)部凸起開始消失；2級表示線粒體腫脹，基質(zhì)透明；3級表示線粒體內(nèi)嵴分裂，基質(zhì)呈透明狀；4級表示線粒體基質(zhì)丟失嚴重，線粒體內(nèi)嵴分裂嚴重，內(nèi)外膜開始缺失，呈現(xiàn)出空泡狀。線粒體損傷評分按式（6）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，平均數(shù)間比較用One-way ANOVA中的多重比較。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮牛肉貯藏過程中肌紅蛋白相對含量的變化

圖1 冷鮮牛肉貯藏過程中3 種形式肌紅蛋白的相對含量Fig.1 Relative contents of three myoglobins in beef muscle

健康畜禽屠宰后的胴體色澤由鮮紅色變?yōu)榘导t色主要是由于MbO2氧化成為了MetMb，MetMb不能及時還原為MbO2，造成MetMb的積累，從而使肉色逐漸向MetMb的深紅色發(fā)展。由圖1可見，在貯藏過程中，DeoMb相對含量與MbO2相對含量均逐漸下降，而MetMb相對含量則逐漸上升。

2.2 冷鮮牛肉貯藏時間對線粒體耗氧量的影響

表1 冷鮮牛肉貯藏時間對肌細胞線粒體呼吸的影響Table1 Effect of storage time on oxygen consumption of mitochondria in beef

由表1可見，ST3和ST4隨著貯藏時間的延長而降低，說明線粒體的呼吸功能在貯藏期間逐漸衰竭，能量代謝減緩。由于屠宰放血后機體死亡，而器官、組織的機能并沒有同時停止運作，細胞仍在進行各種生命活動。線粒體離體后仍能進行一段時間的正常工作，當(dāng)胴體血液循環(huán)停止或氧氣供應(yīng)中斷時，線粒體呼吸功能由有氧呼吸逐漸轉(zhuǎn)為無氧呼吸。其中貯藏時間9～21 d的耗氧量與0 d相比有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 冷鮮牛肉貯藏時間對肌細胞MPTP開放程度、MMP和ATP含量的影響

表 2 貯藏時間對肌細胞MPTP開放程度、MMP與ATP含量的影響Table2 Effect of storage time on mitochondrial permeability transition pore and membrane potential and ATP content in beef

MPTP屬于多種蛋白組成的蛋白復(fù)合體，其位于線粒體內(nèi)、外膜上[27]。由表2可知，隨著貯藏時間的延長，MPTP開放程度呈增大的趨勢，其中貯藏6～21 d的MPTP開放程度與0 d相比有顯著性差異（P＜0.05）。隨著貯藏時間延長，MMP呈降低的趨勢，其中貯藏6～21 d的線粒體MMP與0 d相比有顯著性差異（P＜0.05）。在貯藏過程中，MPTP開放使線粒體呼吸功能減退，從而導(dǎo)致線粒體MMP下降。貯藏3 d后，肌細胞中的ATP含量迅速降低，12 d后已檢測不出，可能是隨著貯藏時間的延長，肌肉中ATP酶變性失活導(dǎo)致。

2.4 冷鮮牛肉貯藏過程中SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量

表 3 貯藏時間對線粒體SOD、GSH-Px、CAT活力與MDA含量的影響Table3 Effect of storage time on mitochondrial SOD, GSH-Px, CAT and MDA levels in beef

由表3可見，隨著貯藏時間的延長，SOD、GSH-Px、CAT活力降低，MDA含量先上升后下降。SOD、GSH-Px是機體兩種主要的自由基清除酶，其活性可以反映機體清除氧自由基的能力[28]。貯藏0～9 d肌細胞線粒體內(nèi)MDA含量明顯升高，說明線粒體內(nèi)氧自由基積累且無法及時分解。因此，貯藏0～9 d內(nèi)線粒體SOD、GSH-Px、CAT活力降低，MDA含量上升，與線粒體的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

2.5 冷鮮牛肉貯藏過程中線粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)變化

隨著牛肉貯藏時間的延長，線粒體腫脹，內(nèi)部基質(zhì)逐漸出現(xiàn)顆粒減少，內(nèi)嵴分裂，內(nèi)部出現(xiàn)囊泡，隨后線粒體膜破裂崩塌，或形成空泡狀結(jié)構(gòu)，損傷達到一定程度后，線粒體膜發(fā)生破裂。

圖2 各損傷等級的線粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)（×60 000）Fig.2 Internal ultrastructure of mitochondria under different damage conditions (× 60 000)

選取6、15、21 d的超微結(jié)構(gòu)圖分別作為6～9、12～15、18～21 d的代表，因為這3 d的圖中相應(yīng)線粒體類型較多，具體如圖2所示。貯藏0 d（圖2A）的肌細胞線粒體呈比較規(guī)則的圓形或卵圓形，輪廓較為分明，結(jié)構(gòu)完整，外膜完整光滑，基質(zhì)分布均勻，內(nèi)脊密集且清晰可見。貯藏3 d（圖2B）與0 d的肌細胞線粒體相比無明顯變化，外膜依然光滑完整，內(nèi)部結(jié)構(gòu)較良好，內(nèi)脊輪廓清晰可見，少部分線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)開始發(fā)生變化；貯藏6 d（圖2C）肌細胞線粒體外膜基本完整，出現(xiàn)輕度的破損，內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本良好，內(nèi)脊開始分裂且數(shù)量減少；貯藏15 d（圖2D）肌細胞線粒體外膜出現(xiàn)一定程度的破損，內(nèi)脊開始大量分裂減少，膜結(jié)構(gòu)開始有些模糊；貯藏18～21 d（圖2E）的肌細胞線粒體絕大部分的線粒體外膜已經(jīng)腫脹變性，破損溶解，內(nèi)脊嚴重降解消失不見，基質(zhì)透明，并出現(xiàn)空泡化，說明此時線粒體結(jié)構(gòu)已嚴重受損。在不同貯藏時間下5 個級別的肌細胞線粒體都存在，只是所占比例不同。

2.6 冷鮮牛肉貯藏過程中線粒體f l ameng評分

由表4可得，貯藏時間與肌細胞線粒體的損傷程度成正比。貯藏時間越長，其平均評分值越大。由圖2、表4可知，當(dāng)貯藏時間達到21 d時，線粒體絕大部分發(fā)生自我損傷現(xiàn)象。在4 ℃貯藏過程中（0～21 d），0級線粒體數(shù)量逐漸減少，1～3級線粒體數(shù)量先增加后減少，4級線粒體數(shù)量逐漸增多，線粒體總評分先降低后升高，平均評分值從0.986 8升高到2.533 8，表明肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)完整性逐漸降低。

表4 fl ameng線粒體評分統(tǒng)計結(jié)果Table4 Statistical results of mitochondria using fl ameng score standard

2.7 冷鮮牛肉貯藏過程中線粒體外部形貌變化

原子力顯微鏡可以對線粒體的外貌進行掃描，并找出對應(yīng)線粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)變化5 個階段（0～4 級）的外部形貌。

圖3 各損傷等級的線粒體外表形貌Fig.3 Exterior morphology of mitochondria at each level

如圖3所示，貯藏前期（0 d）（圖A），線粒體結(jié)構(gòu)較為完整，外膜完整光滑，高度相對較高；隨貯藏時間延長（圖3B～E），線粒體高度降低，表面積增大，呈現(xiàn)塌陷狀，線粒體嵴的囊泡化引起線粒體內(nèi)膜不斷伸展并壓迫外膜，使其重新變得光滑。線粒體表面形貌的變化可能是線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐步破壞導(dǎo)致的。線粒體從完整到破壞經(jīng)過兩個途徑：一是線粒體部分膜結(jié)構(gòu)先被分解，再加之內(nèi)部增大的張力，從而使線粒體從一個小的突破點破裂，此時線粒體可能并沒有腫脹，直徑大小變化不明顯，但是內(nèi)部基質(zhì)發(fā)生泄漏，從而使線粒體也發(fā)生了坍塌；另一種是，線粒體外膜結(jié)構(gòu)完整，但是線粒體腫脹現(xiàn)象嚴重，內(nèi)部結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，從而呈一個球狀囊體結(jié)構(gòu)，直徑較完整時增大，損傷到最后，內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)消失，線粒體內(nèi)部各種酶紊亂作用，促進內(nèi)部結(jié)構(gòu)自溶，內(nèi)部嵴完全分裂，基質(zhì)變透明，當(dāng)線粒體內(nèi)部達到一定的張力時，線粒體膜發(fā)生破裂，內(nèi)外部結(jié)構(gòu)發(fā)生崩塌[29-31]。

2.8 冷鮮牛肉貯藏過程中線粒體結(jié)構(gòu)及功能損傷與肌紅蛋白氧化狀態(tài)的關(guān)系

在貯藏期間牛肉肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)受到損傷，其功能也隨之受到影響。線粒體結(jié)構(gòu)損傷程度及功能變化與肌紅蛋白氧化狀態(tài)的相關(guān)性分析結(jié)果見表5。

表5 冷鮮牛肉貯藏過程中線粒體結(jié)構(gòu)損傷程度及功能變化與肌紅蛋白氧化狀態(tài)的相關(guān)系數(shù)Table5 Correlation coeff i cients between mitochondrial structural injury and functional changes and Mb oxidation state

從表5中可以看出，線粒體結(jié)構(gòu)損傷及功能變化與肉色穩(wěn)定性有密切的關(guān)系，主要表現(xiàn)在背最長肌的RCR與MbO2相對含量極顯著正相關(guān)（r＝0.885）（P＜0.01）。MMP與MetMb相對含量極顯著負相關(guān)（r＝－0.902）（P＜0.01），表明隨著MMP的升高，其MetMb相對含量逐漸降低。

線粒體RCR與MbO2相對含量呈極顯著正相關(guān)，與MetMb相對含量呈極顯著的負相關(guān)（P＜0.01），說明隨著線粒體RCR升高，MbO2相對含量升高，MetMb相對含量降低，間接說明了線粒體結(jié)構(gòu)損傷會使肉色的穩(wěn)定性降低。MMP與MbO2相對含量呈極顯著正相關(guān)（P＞0.05），與MetMb相對含量呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），MPTP開放程度與MbO2相對含量呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），與MetMb相對含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明隨著線粒體膜通透性的升高，MbO2相對含量降低，MetMb相對含量升高；隨著MMP的降低，MbO2相對含量降低，MetMb相對含量升高，體內(nèi)自由基無法得到及時的消除，并逐漸積累，其電離子非?；钴S，容易與肌紅蛋白分子中的極性殘基和非極性殘基結(jié)合，使其分子中的疏水區(qū)“隱藏”起來，使Fe2＋更容易被氧化，從而影響了Fe2＋與O2的可逆結(jié)合，最終導(dǎo)致MetMb還原為MbO2的速率降低，使肉色出現(xiàn)劣變。

此外，MMP與RCR、ATP含量均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.936、0.926，說明RCR與ATP含量隨著MMP的降低而降低，表明線粒體結(jié)構(gòu)與功能之間的密切關(guān)系。

3 結(jié) 論

隨著貯藏時間的延長，線粒體結(jié)構(gòu)損傷嚴重，表現(xiàn)為膜通透性增大、線粒體形態(tài)和大小異常、正常的線粒體數(shù)量減少，進而導(dǎo)致其功能降低，SOD、GSH-Px、CAT活力降低，代謝產(chǎn)物MDA含量先升高后降低等。MMP與MbO2相對含量呈極顯著正相關(guān)，與MetMb相對含量呈顯著負相關(guān)；MPTP與MbO2相對含量呈極顯著負相關(guān)，與MetMb相對含量呈極顯著正相關(guān)，且線粒體功能的下降降低了肉色的穩(wěn)定性。