■董春燕 姚 麗 邵 儉 安 苗 文 明 姜海波*

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；3.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025）

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）是我國重要的冷水性經(jīng)濟(jì)魚類[1]。近年來，我國虹鱒的養(yǎng)殖發(fā)展迅猛，至2017 年養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)到4.146 萬噸[2]。然而病害頻發(fā)卻成為影響產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要限制因素。以往普遍采用抗生素類藥物進(jìn)行治療，不僅會(huì)造成較高的藥物殘留，降低水產(chǎn)品安全性，而且還會(huì)污染水體。因此，尋找安全的抗生素替代物，用于病害防治成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

中草藥具有高效、低毒、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，作為飼料在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中具有廣闊的應(yīng)用前景[3-4]。目前有科研人員用黃芪、肉叢蓉、川芎、金銀花、紅花、五味子、柴胡、魚腥草、白花蛇舌草、石斛、白術(shù)、白頭翁、絞股藍(lán)、桑螵蛸、甘草、板藍(lán)根、天麻等25味中草藥配成中藥方劑，開展了提升虹鱒免疫機(jī)能的研究探索，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血液樣品的免疫學(xué)指標(biāo)差異顯著，表明中藥方劑具有提高免疫力的效果[5]。以茵陳、板藍(lán)根為復(fù)方一，紫草、金銀花為復(fù)方二研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方一比復(fù)方二更有效地提高虹鱒的抗氧化能力[6]。本實(shí)驗(yàn)以虹鱒作為研究對(duì)象，來探討水浸提物對(duì)虹鱒外周血白細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性的影響。旨在初步篩選出能有效提高虹鱒免疫力和抗病能力的免疫增強(qiáng)劑，為虹鱒中草藥免疫增強(qiáng)劑的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用17 種中草藥購自貴陽市援生醫(yī)院，中草藥的中文名及拉丁文名如表1 所示。實(shí)驗(yàn)用魚為貴州麗水生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司大山三文魚養(yǎng)殖場(chǎng)提供，共十五條，其平均體重為1.5 kg左右。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中草藥的初步處理及中草藥濃縮提取液樣品的制備

從待用中草藥中各稱取30 g，分別放置于干燥烘箱中，設(shè)置成恒溫50 ℃烘烤24 h使其完全干燥；將各種中草藥用中草藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎后，用60目篩過篩并密封保存藥粉，于室溫干燥保存。17種中草藥各稱取2 g粉末放入100 ml燒杯中，后加入80 ml蒸餾水，煎煮至20 ml；靜置冷卻后去掉上清液體，再倒入蒸餾水80 ml，此方法重復(fù)三次；8 500 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm的無菌濾膜過濾，制成中草藥常溫濃縮提取液樣品備用。

表1 中草藥中文名及拉丁文名

1.2.2 虹鱒白細(xì)胞的準(zhǔn)備

取3 尾虹鱒，用MS-222（200 mg/l）麻醉后，再用75%酒精棉球擦拭魚體，置超凈工作臺(tái)中的托盤上，尾靜脈采血。取血用注射器為含有0.3 ml肝素鈉（濃度：1 500 U 肝素鈉溶于1 ml PBS 中）的10 ml 一次性注射器。將所有血液混合，加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)基（L-15 IV）。另取10 ml離心管，加入1.5 ml梯度分離液，沿管壁緩慢加入3 ml 稀釋后的血液，使血液和細(xì)胞分離液有明顯的分離界面。室溫以2 000 r/min離心10 min；取中間層白細(xì)胞于新離心管內(nèi)，加1 ml L-15 IV 輕輕混合均勻；取20 μl 細(xì)胞，加入等體積的0.2%盼藍(lán)，顯微鏡下數(shù)數(shù)得到細(xì)胞懸液初始濃度；用L-15 IV將其稀釋成2×107cell/ml 作氧負(fù)離子檢測(cè)；5×106cell/ml作吞噬活性檢測(cè)。

1.2.3 中草藥對(duì)外周血白細(xì)胞吞噬活性的影響

檢測(cè)中草藥對(duì)外周血白細(xì)胞吞噬活性的影響。將實(shí)驗(yàn)分為中草藥添加組和對(duì)照組，取1.5 ml無菌離心管，加入100 μl白細(xì)胞懸液（5×106cell/ml），在中草藥組添加中草藥提取液樣品100 μl，對(duì)照組加PBS 100 μl，室溫孵育1 h；每管加入100 μl 的乳膠微球，輕輕混勻，室溫孵育1 h，吸去載玻片中的液體，加戊二醛100 μl，室溫固定5 min，吸去液體，加入Giemsa染色0.5 h，蒸餾水沖洗，自然晾干。在油鏡下分別取5個(gè)視野觀察計(jì)數(shù)，每種中草藥平行檢測(cè)3次，計(jì)算吞噬活性率（PA）和吞噬指數(shù)（PI）。

根據(jù)PA 和PI 測(cè)定結(jié)果，篩選能同時(shí)提高虹鱒吞噬活性的中草藥。

1.2.4 白細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性的測(cè)定

取96 孔板，每一行為一組，每組又分A、B 2 個(gè)亞組，每個(gè)亞組3個(gè)孔，96孔板的第一行為對(duì)照組，其余各行為中草藥提取液樣品組。每孔加入5×106cell/ml白細(xì)胞懸液100 μl；中草藥樣品組的各孔再加入制備的中草藥提取液100 μl，對(duì)照組的各加入PBS 100 μl。室溫孵育2 h后，每孔吸去上清200 μl，用100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液L-15 洗滌3 次；A 亞組各孔添加50 μl 細(xì)胞培養(yǎng)基L-15，B 亞組各孔添加細(xì)胞培養(yǎng)液L-15 和NBT各50 μl，再用PBS 將所有各孔補(bǔ)齊到200 μl。室溫孵育1 h 后，每孔吸去100 μl 上清，加100 ml 甲醇固定3 min，再吸去100 μl上清，用100 μl甲醇（70%）洗滌3 次。輕輕吸去各孔內(nèi)的所有液體，室溫風(fēng)干后，每孔加入2 mol/l KOH 100 μl 和DMSO 200 μl；用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD 630 nm 值，分別計(jì)算B 組氧呼吸爆發(fā)活性（SPO），B 組氧呼吸爆發(fā)活性提高率活性[NBTB（%）]。

2 結(jié)果

2.1 白細(xì)胞吞噬活性測(cè)定結(jié)果（見表2）

表2 不同中草藥對(duì)虹鱒外周血白細(xì)胞吞噬活性和吞噬指數(shù)的影響

由表2 可知，對(duì)照組吞噬活性（PA 值）達(dá)到（0.28±0.024）、吞噬指數(shù)（PI 值）為（1.31±0.04）。天麻組的吞噬指數(shù)（PI 值）低于對(duì)照組，表明天麻會(huì)抑制虹鱒外周血白細(xì)胞的吞噬活性；白芨、厚樸、麻黃、丹參、大黃、馬齒莧、澤瀉、黃柏、蒼耳子、貫眾、紅景天11 種中草藥添加組的吞噬活性（PA 值）顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），蒲公英組的吞噬指數(shù)（PI 值）顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 氧呼吸爆發(fā)活性測(cè)定結(jié)果

對(duì)17種中草藥添加組進(jìn)行白細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3：白頭翁、桂桔、白芨、大黃、貫眾、紅景天中草藥添加組的SPO 值顯著高于對(duì)照組；16種中草藥的NBTB（%）都大于15%。

表3 不同中草藥對(duì)虹鱒血白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大黃、白芨、紅景天和貫眾這4 種中草藥既可同時(shí)提高虹鱒外周血白細(xì)胞的氧呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性。大黃在水產(chǎn)動(dòng)物方面研究較多，有研究發(fā)現(xiàn)在草魚（Ctenopharyngodonidellus）飼料中添加大黃能顯著或極顯著增強(qiáng)草魚血細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)[5]；陳孝煊研究報(bào)道大黃可明顯提高異育銀鯽（Allogynogeneticcrucian carp）血液白細(xì)胞吞噬能力[7]；而吞噬活性作為魚類的一種免疫參數(shù)，白細(xì)胞吞噬能力的高低能直接反映出魚類非特異性免疫能力的大小，大黃提取物主要成分大黃素等能促進(jìn)建鯉（Cyprinuscarpiovar. Jian）的生長，增強(qiáng)魚體的免疫力[8]。紅景天對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞的吞噬能力有顯著提升作用[9]；紅景天能夠通過增加尼羅羅非魚（Oreochromisniloticus）血液中紅細(xì)胞體積、胞內(nèi)血紅蛋白含量以及血細(xì)胞比容來改善其血液免疫系統(tǒng)，以此來提高其氧呼吸爆發(fā)活性[10]。王慶奎研究表明貫眾可提高斑點(diǎn)叉尾鮰血液白細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)，從而提高斑點(diǎn)叉尾鮰（IetalurusPunetaus）血液白細(xì)胞吞噬能力[11]；貫眾實(shí)驗(yàn)組中哲羅鮭（Huchotaimen）各組織超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性有明顯的升高，其中以血細(xì)胞SOD活性提升最為顯著[12]；SOD是自由基損害的主要防御酶，可催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)，從而阻斷自由基的連鎖反應(yīng)，提高氧呼吸爆發(fā)活性。根據(jù)對(duì)虹鱒的氧呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性的測(cè)定表明，在飼料中添加一定量的大黃、白芨、貫眾和紅景天可以提高虹鱒的非特異性免疫機(jī)能，但作用機(jī)理還有待更深入研究。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，篩選出白芨、大黃、貫眾、紅景天4 種中草藥能夠顯著提高虹鱒外周血白細(xì)胞的氧呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性，為虹鱒中草藥免疫增強(qiáng)劑組合方劑的設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。