吳 昊，林 慶，徐 全，柳陽(yáng)春，陳立如，尹 隨

江西省人民醫(yī)院心胸外科 南昌 330000

肺癌是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，是所有惡性腫瘤里發(fā)病率最高，造成癌癥死亡最多的疾病[1]；非小細(xì)胞肺癌是肺癌常見(jiàn)的病理類型，約占80%[2]，其中又以肺腺癌最常見(jiàn)。我國(guó)是肺癌的高發(fā)區(qū)，然而，目前傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放療和化療治療肺癌的效果并不理想[3]。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因治療已成為肺癌研究中的熱門(mén)課題。探討肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)治療肺癌具有重要意義。

上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2(epithelial cell transforming sequence 2 oncogene,ECT2)最早在小鼠NIH/3T3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)調(diào)控Rho GTP酶介導(dǎo)上游小G蛋白家族成員的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期[4]。人類ECT2基因定位于人3q26染色體上，可編碼883個(gè)氨基酸。有報(bào)道[5-8]證實(shí)，ECT2是一種與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的癌基因，在結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤和胃癌等多種腫瘤組織中異常高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本研究探討沉默ECT2表達(dá)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞周期分布和凋亡的影響，以期進(jìn)一步闡明ECT2在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑A549細(xì)胞(上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，青霉素、鏈霉素和Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)，兔多克隆抗體P53、鼠單克隆抗體CyclinD1和鼠多克隆抗體β-actin(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗ECT2多克隆抗體、兔抗Cleaved Caspase-3多克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(美國(guó)Abcam公司)，凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司)，BCA試劑盒(北京康為世紀(jì)生物公司)。ECT2-siRNA及其陰性對(duì)照序列NC-siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)凍存A549細(xì)胞經(jīng)水浴解凍復(fù)蘇后，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。顯微鏡下監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至75%融合時(shí)，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組與處理將A549細(xì)胞分為空白組、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照NC-siRNA)、干擾組(轉(zhuǎn)染ECT2-siRNA)。轉(zhuǎn)染前24 h，將A549細(xì)胞以每孔3×104個(gè)接種于6孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中siRNA終濃度為20 μmol/L。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4ECT2-siRNA干擾的效果采用Western blot檢測(cè)ECT2蛋白的表達(dá)。A549細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法定量總蛋白后，以每孔60 μg的上樣量行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。采用含50 g/L脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h后，加入ECT2(按1∶500稀釋)和β-actin(按1∶1 000稀釋)抗體，4 ℃下孵育過(guò)夜。封閉液洗膜后，加入1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃下孵育1 h。經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑顯色后，用凝膠圖像處理軟件分析條帶的灰度值。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞周期的檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，經(jīng)預(yù)冷磷酸緩沖液重懸細(xì)胞后，以預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇固定30 min。加入染色液(含RNase和PI)染色20 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞凋亡的檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，以預(yù)冷磷酸緩沖液洗滌3次后，加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加體積各為5 μL的Annexin V-FITC和PI避光處理15 min，補(bǔ)加結(jié)合緩沖液300 μL，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1，凋亡相關(guān)蛋白P53和Cleaved Caspase-3(一抗分別按1∶500、1∶500和1∶1 000稀釋)的表達(dá)，具體步驟參照1.4。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)，3組間以上指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1ECT2-siRNA干擾效果結(jié)果見(jiàn)圖1?？瞻捉M、陰性對(duì)照組和干擾組細(xì)胞中ECT2蛋白的表達(dá)水平分別為(0.72±0.05)、(0.75±0.06)和(0.13±0.02)，3組間相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=169.246，P<0.001)；與空白組和陰性對(duì)照組相比，干擾組ECT2蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)。

1～3組：分別為空白組、陰性對(duì)照組和干擾組

2.23組細(xì)胞周期分布比較與空白組和陰性對(duì)照組相比，干擾組G0/G1期細(xì)胞百分比升高，S期和G2/M期細(xì)胞百分比降低(P<0.05)；而陰性對(duì)照組與空白組G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.33組細(xì)胞凋亡率比較與空白組和陰性對(duì)照組相比，干擾組細(xì)胞的凋亡率升高。見(jiàn)表1。

表1 3組細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡率比較(n=3) %

*:與其他2組相比，P<0.05

2.43組細(xì)胞CyclinD1、P53和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平的比較與空白組和陰性對(duì)照組相比，干擾組P53和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平升高，而CyclinD1蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

1～3組：分別為空白組、陰性對(duì)照組和干擾組

表2 3組細(xì)胞CyclinD1、P53和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平(n=3)

*:與其他2組相比，P<0.05

3 討論

研究[9-11]表明，ECT2是一種與肺癌、乳腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的癌基因，其在腫瘤組織中表達(dá)水平越高，患者的預(yù)后越差。Iyoda等[12]研究指出，ECT2在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)后可通過(guò)上調(diào)p21、p27和下調(diào)CyclinD1、CyclinE、CDK4導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。Xu等[13]研究發(fā)現(xiàn)ECT2可被miRNA-223靶向調(diào)控，下調(diào)其表達(dá)可誘導(dǎo)p21表達(dá)，改變Cyclin D1-CDK復(fù)合物的活性，將細(xì)胞阻滯于G1期，影響骨肉瘤細(xì)胞周期進(jìn)展。Xie等[14]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)下調(diào)ECT2能有效抑制骨肉瘤OS細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)下調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)抑制OS細(xì)胞侵襲和遷移。另外，沉默乳腺癌細(xì)胞中ECT2表達(dá)后可通過(guò)ERK/miR-101/Rac1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]?？梢?jiàn)，ECT2可通過(guò)多種機(jī)制參與細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡等過(guò)程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

細(xì)胞周期是一個(gè)高度有序的運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程，其調(diào)控紊亂是腫瘤細(xì)胞失控性增殖進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因[16]。除了細(xì)胞異常增殖外，腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的傾向和能力降低也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡正逐漸成為一種發(fā)展中的腫瘤治療手段[17]。本研究結(jié)果顯示，ECT2-siRNA可沉默肺腺癌A549細(xì)胞中ECT2的表達(dá)；ECT2沉默后A549細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，細(xì)胞凋亡率升高；進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CyclinD1蛋白的表達(dá)水平降低，而P53和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平升高。CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的重要調(diào)控者，在細(xì)胞由G1期進(jìn)入到S期中發(fā)揮推動(dòng)作用；此外，CyclinD1也是公認(rèn)的原癌基因，其過(guò)度表達(dá)可致細(xì)胞增殖失控[18]。P53是一種重要的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，也是一種重要的抑癌基因，其表達(dá)增多可使細(xì)胞周期停滯于G1期并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19-20]。Caspase-3處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的主要效應(yīng)因子，其活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的重要標(biāo)志[21]，其中Cleaved Caspase-3是其重要的活化形式。本研究結(jié)果提示，沉默ECT2可通過(guò)下調(diào)CyclinD1和上調(diào)P53、Cleaved Caspase-3的表達(dá)誘導(dǎo)A549細(xì)胞周期阻滯和凋亡。

綜上所述，靶向沉默ECT2表達(dá)可誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞周期阻滯和凋亡，而CyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào)和P53、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)可能是ECT2抑制肺腺癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。該結(jié)果進(jìn)一步闡明了ECT2在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，ECT2有望成為肺癌治療的新靶點(diǎn)。