程少燕，李 峰，平 玉，趙啟泰，吳欣愛(ài)，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫和生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

CD8+T細(xì)胞是重要的抗腫瘤免疫細(xì)胞，通過(guò)T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)的特異性識(shí)別后激活產(chǎn)生IFN-γ、顆粒酶B(granzyme B，GZMB)和穿孔素等因子，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。研究[1-2]表明腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞的功能被明顯抑制，呈現(xiàn)一種耗竭狀態(tài)，包括免疫檢查點(diǎn)(如PD-1、Tim-3)表達(dá)的上調(diào)，以及功能性細(xì)胞因子表達(dá)的下降等。既往研究[3]發(fā)現(xiàn)在CD8+T細(xì)胞TCR信號(hào)激活的過(guò)程中Notch1信號(hào)通路也被激活，Notch1信號(hào)通路異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Notch1作為一種高度保守的跨膜蛋白，主要影響CD8+T細(xì)胞的發(fā)育和分化[4-5]，而對(duì)其功能、增殖及免疫檢查點(diǎn)表達(dá)的影響尚不清楚[6-7]。本研究觀察了抑制Notch1信號(hào)通路對(duì)活化的CD8+T細(xì)胞功能、增殖以及免疫檢查點(diǎn)表達(dá)等的影響，探討Notch1信號(hào)通路在CD8+T細(xì)胞中發(fā)揮作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料及試劑淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆薈D8+T細(xì)胞分選磁珠、分選柱購(gòu)自德國(guó)Mitenyi Biotec公司，CD8+T細(xì)胞活化磁珠購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，流式熒光抗體(CD8-APC-Cy7、PD-1-PE-Cy7、TIM-3-PE、GZMB-PE、IFN-γ-APC、IL-2-APC、Ki-67-PerCP)均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，Notch1抑制劑(LY3039478)購(gòu)自美國(guó)Selleck生物科技有限公司，重組人白細(xì)胞介素-2(IL-2)購(gòu)自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司,RPMI 1640培養(yǎng)基、佛波醇酯類多克隆刺激劑(PMA)、離子霉素、布雷桿菌A(BFA)等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。

1.2CD8+T細(xì)胞分組及激活外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離、CD8+T細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。將獲得的CD8+T細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組加入CD3/CD28激活微珠，以淋巴細(xì)胞∶CD3/CD28激活微珠=2∶1的比例(數(shù)量比)激活CD8+T淋巴細(xì)胞[9-10]。實(shí)驗(yàn)組在加入同樣活化微珠的同時(shí)加入50 μmol/L LY3039478。繼續(xù)培養(yǎng)0～72 h后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.32組細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的檢測(cè)分別收集培養(yǎng)0、24、48、72 h后的2組細(xì)胞，PBS洗滌2次，1 500 r/min離心5 min，棄上清后避光加入CD8-APC-Cy7、PD-1-PE-Cy7、TIM-3-PE抗體，4 ℃孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.42組細(xì)胞內(nèi)功能性細(xì)胞因子和Ki-67的檢測(cè)分別收集培養(yǎng)48和72 h后的2組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，分別加入50 μg/L的PMA和750 μg/L的離子霉素，置于培養(yǎng)箱中孵育3 h，加入BFA 1 mg/L[11]，充分混合，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。收取細(xì)胞于1.5 mL離心管中，PBS洗滌2次，1 500 r/min離心5 min，棄上清后避光加入APC-CY7-CD8抗體，4 ℃孵育15 min，離心棄上清，每管加入400 μL固定劑重懸細(xì)胞，4 ℃避光孵育30 min，離心棄上清，加入400 μL破膜劑，4 ℃避光孵育30 min，離心棄上清，對(duì)應(yīng)管加入IFN-γ、IL-2、GZMB和Ki-67抗體，4 ℃避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較不同時(shí)間點(diǎn)2組細(xì)胞中PD-1、Tim-3表達(dá)的差異，應(yīng)用；兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組細(xì)胞中GZMB、IFN-γ、IL-2、Ki-67表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.12組CD8+T細(xì)胞PD-1和Tim-3表達(dá)的比較見(jiàn)表1。由表1可知，隨著活化時(shí)間的延長(zhǎng)，2組細(xì)胞PD-1、TIM-3的表達(dá)均增加；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組CD8+T細(xì)胞PD-1和TIM-3的表達(dá)明顯降低。

表1不同時(shí)間點(diǎn)2組CD8+T細(xì)胞PD-1和TIM-3的表達(dá)(n=3)

t(培養(yǎng))/hPD-1對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組TIM-3對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組02.53±0.382.53±0.381.43±0.701.43±0.702412.70±1.437.10±1.448.77±1.368.77±1.364824.43±2.7211.10±2.1321.20±2.0711.37±1.077235.87±2.9117.57±3.9734.23±2.8020.77±1.26F組間(P)34.340(<0.001)30.570(<0.001)F時(shí)間(P)42.710(<0.001)102.500(<0.001)F交互(P)6.501(0.004)10.080(<0.001)

2.22組CD8+T細(xì)胞功能性細(xì)胞因子和Ki-67表達(dá)的比較見(jiàn)圖1、表2。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組CD8+T細(xì)胞中GZMB、IFN-γ、 IL-2和Ki-67的表達(dá)均明顯下降。

圖1 2組CD8+T細(xì)胞功能性細(xì)胞因子和Ki-67的表達(dá)

表22組CD8+T細(xì)胞功能性細(xì)胞因子和Ki-67的表達(dá)(n=3)

組別GZMBIL-2IFN-γKi-67對(duì)照組64.76±4.6546.33±2.2347.06±3.7654.70±13.60實(shí)驗(yàn)組23.70±3.5725.27±5.8828.33±4.7130.87±4.86t12.5306.9605.3832.859P<0.0010.0020.0060.042

3 討論

Notch是廣泛存在于多種細(xì)胞表面的跨膜受體蛋白，在哺乳動(dòng)物中存在4種Notch受體(Notch1～4)和5種Notch配體(Delta-like1、3、4和Jagged1、2)，其中Notch1的研究最為廣泛[12]。鄰近細(xì)胞的配體和受體相互作用后Notch1信號(hào)通路被激活，激活后的Notch1蛋白經(jīng)過(guò)剪切形成胞內(nèi)段，在哺乳動(dòng)物中胞內(nèi)段和RBP-JK結(jié)合形成復(fù)合體，后進(jìn)入胞核作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄[13]。Notch1信號(hào)通路異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。如在急性淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)中普遍存在Notch1的突變，γ分泌酶抑制劑可以抑制Notch1胞內(nèi)段的剪切釋放，在不改變Notch1本身表達(dá)水平的情況下抑制其下游靶基因的表達(dá)，能有效地阻礙Notch1信號(hào)通路的活化，抑制其致癌作用[14]。此外在實(shí)體瘤如肺癌、宮頸癌、膠質(zhì)瘤等中也常見(jiàn)Notch1的異常表達(dá)，其對(duì)腫瘤的代謝、生長(zhǎng)、周期等過(guò)程都起到調(diào)控作用[15]。

Notch1信號(hào)通路在T細(xì)胞中的研究主要集中在CD4+T細(xì)胞，包括調(diào)控CD4+T細(xì)胞的分化、增殖以及影響多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，雖然結(jié)果不盡相同，但是大部分研究[16-17]表明Th2細(xì)胞的分化依賴于Notch1信號(hào)通路，敲除RBP-JK可促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1亞型分化。CD8+T細(xì)胞作為最重要的抗腫瘤免疫細(xì)胞，可以通過(guò)直接接觸殺傷腫瘤細(xì)胞，也可以通過(guò)間接分泌GZMB、IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子發(fā)揮生物學(xué)功能。Notch1信號(hào)通路對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的影響也存在爭(zhēng)議，有研究[5, 18]發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)通路促進(jìn)效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的增殖和活化，但也有研究[7]表明在條件敲除Notch1的小鼠中CD8+T細(xì)胞的增殖和激活并未有明顯改變。本研究發(fā)現(xiàn)抑制Notch1信號(hào)通路可以抑制CD8+T細(xì)胞的增殖，功能性細(xì)胞因子的產(chǎn)生也明顯降低，提示Notch1信號(hào)通路的激活促進(jìn)了CD8+T細(xì)胞的功能，利于其抗腫瘤作用的發(fā)揮。

免疫檢查點(diǎn)是重要的免疫抑制分子，在初始T細(xì)胞表面基本不表達(dá)，但在T細(xì)胞活化后其表達(dá)明顯上調(diào)；免疫檢查點(diǎn)與其相應(yīng)配體合后，產(chǎn)生抑制性信號(hào)，負(fù)向調(diào)節(jié)活化性T細(xì)胞的功能，從而抑制免疫應(yīng)答[19]。在腫瘤及慢性病毒感染患者中，感染的基質(zhì)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1，與表達(dá)PD-1的CD8+T細(xì)胞相互作用后導(dǎo)致T細(xì)胞功能耗竭[20]。本研究結(jié)果顯示在抑制Notch1信號(hào)通路后CD8+T免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)下降。

綜上所述，Notch1信號(hào)通路在T細(xì)胞活化、功能和增殖方面有重要的調(diào)控作用。