閻玉婷，許永枝，何珠龍，高俊明

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.沁水縣農(nóng)業(yè)委員會(huì)，山西 沁水 048200）

谷子是一種起源于我國(guó)的古老農(nóng)作物，被古人譽(yù)為“五谷之長(zhǎng)”[1]，具有特殊的食療食補(bǔ)作用。近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平和人民生活水平的不斷提高，人們的健康意識(shí)不斷增強(qiáng)，對(duì)特色小雜糧的需求量逐年增大，小雜糧單位面積種植收益也顯著提高[2]。沁州黃小米是我國(guó)四大名米中產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)運(yùn)作最好的，以沁州黃為主的山西小米備受國(guó)內(nèi)外華人青睞，巨大的市場(chǎng)需求和不斷提升的生產(chǎn)效益拉動(dòng)了山西谷子產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展。但隨著谷子種植面積的不斷增加，輪作年限縮短，積年流行性的谷子白發(fā)病在山西各個(gè)谷子主產(chǎn)區(qū)都呈現(xiàn)了逐年加重的趨勢(shì)，在谷子白發(fā)病發(fā)生較為嚴(yán)重的沁水、沁縣、武鄉(xiāng)等地，其已成為谷子產(chǎn)業(yè)健康和綠色可持續(xù)發(fā)展的主要障礙。

谷子白發(fā)病（Foxtail millet downy mildew）是由卵菌門指梗霉屬的禾生指梗霉（Sclerospora graminicola）侵染引起的一種系統(tǒng)侵染性土傳病害。目前，生產(chǎn)上主要通過(guò)輪作和內(nèi)吸性殺菌劑拌種的方法來(lái)防治該病害[3-6]。但隨著種植面積的擴(kuò)大，輪作越來(lái)越困難，谷子生產(chǎn)對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的依賴性越來(lái)越強(qiáng)，用藥量也逐年增大。這種趨勢(shì)不利于綠色無(wú)公害小雜糧產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，生產(chǎn)上迫切需要綠色無(wú)公害的生物防治技術(shù)。在自然界中廣泛而普遍存在的菌物間重寄生現(xiàn)象是植物病害生物防治的重要資源[7-8]。RAO 等[9]于1976年報(bào)道了一種寄生于谷子白發(fā)病菌卵孢子上的半裸鐮刀菌，WHIPPS 等[10]報(bào)道了寄生于腐霉屬、疫霉屬、指梗霉屬等真菌卵孢子上的一種鐮孢菌。而國(guó)內(nèi)目前尚未見到有關(guān)卵孢子重寄生真菌的報(bào)道。

由于谷子白發(fā)病菌卵孢子是在植物組織內(nèi)形成，在卵孢子上分離出的重寄生菌應(yīng)屬于植物內(nèi)生菌，如果這類植物內(nèi)生菌對(duì)谷子生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有危害，并對(duì)促進(jìn)谷子生長(zhǎng)發(fā)育和提高抗逆性有益，可成為用于谷子白發(fā)病生物防治的候選菌。

本研究從山西省沁水縣谷子白發(fā)病病田采集到的病株上收集卵孢子，并從卵孢子上分離、純化和鑒定出3 株卵孢子重寄生真菌，以期為谷子白發(fā)病的生物防治研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為谷子白發(fā)病菌卵孢子，收集自山西省晉城市沁水縣的谷子白發(fā)病重病田谷子病株上。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）[11]和皮拉依（Bilai′s）培養(yǎng)基[12]，2 種培養(yǎng)基 121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min 后備用。

1.2 重寄生真菌的分離

1.2.1 谷子白發(fā)病菌卵孢子的收集 用剪刀將采集到的谷子白發(fā)病病株上的發(fā)絲部分剪成2～3 cm的小段，使用0.04 mm 網(wǎng)篩對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾，收集過(guò)篩后的卵孢子粉于廣口瓶中保存。

1.2.2 卵孢子表面附著物及雜菌去除 稱取0.1 g干燥的孢子粉加入50 mL 離心管中，加入適量的無(wú)菌石英砂，并加入30 mL 無(wú)菌水。使用渦旋振蕩器渦旋6 min，靜置片刻，待卵孢子自然沉降后，用吸管吸除上清液。底部沉淀加入無(wú)菌水，按照上述操作連續(xù)重復(fù)多次。期間，制作臨時(shí)玻片在10×10 倍顯微鏡下觀察，待卵孢子懸浮液中及卵孢子表面無(wú)附著物時(shí)，即可用于卵孢子重寄生真菌的分離。

1.2.3 卵孢子重寄生真菌的分離 分離時(shí)，首先吸取凈化后的卵孢子懸浮液100 μL 加入直徑9 cm的滅菌空培養(yǎng)皿中，再用適量無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，直至在10×10 倍顯微鏡下觀察視野中卵孢子數(shù)量為25～30 個(gè)為止，然后用移液器吸取單個(gè)卵孢子移接到含鏈霉素的PDA 培養(yǎng)基上，每皿均勻間隔移接10 個(gè)卵孢子，25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，在卵孢子周圍出現(xiàn)菌落前，每天定時(shí)顯微觀察一定數(shù)量的卵孢子，對(duì)卵孢子表面重寄生真菌的生長(zhǎng)情況進(jìn)行拍照。每個(gè)樣本采集點(diǎn)的卵孢子至少應(yīng)移接出100 個(gè)單卵孢子。由于谷子白發(fā)病菌屬專型寄生菌，即便卵孢子萌發(fā)也不能在培養(yǎng)基上形成白發(fā)病菌菌落，因此，卵孢子周圍形成肉眼可見菌落就可斷定其是重寄生菌。

1.2.4 卵孢子重寄生真菌的純化 從單卵孢子上形成的重寄生真菌菌落邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，倒置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)進(jìn)行初步純化，觀察菌絲生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)3 d 后采用尖端菌絲分離法繼續(xù)純化。純化3～4 次經(jīng)觀察無(wú)雜菌，以確保分離得到的菌落為純菌株。將分離純化后的菌株分別進(jìn)行編號(hào)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 重寄生真菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離得到的重寄生真菌接種到直徑 9 cm 的 PDA，Bilai's 培養(yǎng)基上，在 25 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)4～7 d，觀察培養(yǎng)基內(nèi)菌落形態(tài)，挑取菌絲進(jìn)行顯微觀察。對(duì)于分離出的重寄生真菌，采用菌落觀察的方法，結(jié)合顯微觀察中菌絲的形態(tài)特征，根據(jù)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子形態(tài)、大小、分生孢子著生狀態(tài)以及分生孢子梗分枝情況等，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[13]、鐮刀菌種類鑒定的方法等相關(guān)文獻(xiàn)[14-17]對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 采用分子生物學(xué)技術(shù)中rDNA-ITS 序列分析進(jìn)行未知種的鑒定[18-21]。

1.3.2.1 DNA 提取 DNA 提取參考博日試劑盒的提取方法并略有改動(dòng)。

1.3.2.2 PCR 擴(kuò)增 采用真菌rDNA ITS 的通用引物 ITS1（5′-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3′）和 ITS4（5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）對(duì)重寄生真菌基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。2 種引物均由上海生物工程有限公司合成。其擴(kuò)增體系為：2×PCR Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，DNA 模板 1μL，最后用雙蒸水定容到25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 4 min；95 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.2.3 瓊脂糖電泳 取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，將具有特異性條帶的產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的純化與測(cè)序，獲得PCR 產(chǎn)物序列。

1.3.2.4 Blast 分析及序列處理 將測(cè)序結(jié)果中的序列提交至NCBI 中，與GenBank 中的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，查找相似性較高的序列，采用MEGA（6.0）軟件中的臨近法（neighbor-joining，NJ），進(jìn)行1 000 次Bootstrap 檢驗(yàn)計(jì)算系統(tǒng)發(fā)育樹中節(jié)點(diǎn)的置信度，對(duì)重寄生真菌的DNA 序列進(jìn)行多重序列比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

根據(jù)重寄生真菌菌落的生長(zhǎng)速率、菌落顏色、菌落形態(tài)等一系列特征進(jìn)行鑒定。得出分離得到的3 種重寄生真菌均為鐮孢菌，命名為菌株LD1，LD2，LD3。

2.1.1 菌株LD1 的形態(tài)學(xué)鑒定 菌落形態(tài)：Bilai's培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，菌落直徑4.1～4.6 cm。PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，菌落直徑4.3～4.9 cm，蛛網(wǎng)狀，生長(zhǎng)速度中等。菌落顏色呈粉白色，氣生菌絲致密，菌落背面淡紫粉色，外緣菌絲出現(xiàn)消解現(xiàn)象。

分生孢子：小型分生孢子較多，卵形至橢圓形，無(wú)隔。小型分生孢子串生，有時(shí)可在孢子鏈頂端形成類似假頭狀著生，量度為（4.8～16.8）μm×（2.6～3.6）μm。大型分生孢子鐮刀形，3～5 隔，量度為（27.3～45.2）μm×（3.6～4.5）μm。

產(chǎn)孢細(xì)胞：?jiǎn)巍映鰪?fù)瓶梗產(chǎn)孢。

厚垣孢子：無(wú)厚垣孢子（圖1）。

2.1.2 菌株LD2 的形態(tài)學(xué)鑒定 菌落形態(tài)：Bilai's培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，菌落直徑4.5～4.7 cm。PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，菌落直徑4.8～5.3 cm，生長(zhǎng)迅速。菌落顏色呈淡桃紅色至紫色，氣生菌絲致密，羊毛狀，菌落背面淡紫色，表面具有粉狀物。

分生孢子：小型分生孢子較多，紡錘形至卵形，基部稍平展。小型分生孢子呈鏈狀排列，有時(shí)可在孢子鏈頂端形成類似假頭狀著生。量度為（3.4～12.5）μm×（1.7～3.8）μm。

產(chǎn)孢細(xì)胞：?jiǎn)纹抗．a(chǎn)孢。

厚垣孢子：無(wú)厚垣孢子（圖2）。

2.1.3 菌株LD3 的形態(tài)學(xué)鑒定 菌落形態(tài)：Bilai's培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，菌落直徑3.5～4.3 cm。PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，菌落直徑4.6～5.6 cm。氣生菌絲初期白色，棉絮狀，菌落背面淺黃色，后期產(chǎn)生深褐色色素。

分生孢子：中型分生孢子，紡錘形，多為1 分隔。大型分生孢子鐮刀型，稍彎，多為3～5 分隔。量度為（28.3～37.3）μm×（4.5～5.5）μm。

產(chǎn)孢細(xì)胞：?jiǎn)巍?fù)瓶梗，多芽產(chǎn)孢共存。

厚垣孢子：存在極少厚垣孢子，球形，著生于菌絲中部或頂部（圖3）。

2.2 分子鑒定

根據(jù)形態(tài)特征，利用真菌的通用引物ITS1 和ITS4，對(duì)分離純化得到的3 株重寄生真菌進(jìn)行序列測(cè)定。電泳時(shí)使用的Marker 為2 000 bp，其中，750 bp為最亮條帶。從圖4可以看出，3 種重寄生真菌ITS序列的PCR 結(jié)果均在500 bp 左右。

2.2.1 菌株LD1 的分子鑒定 菌株LD1 的ITS 區(qū)共測(cè)序531 個(gè)堿基，在NCBI 中經(jīng)過(guò)Blast 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）菌株的相似性均達(dá)到99%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，菌株LD1 與菌株MG543771.1的親緣關(guān)系最近，與Fusarium 屬其他種類關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)（圖5），結(jié)合該菌株的形態(tài)特征，將其鑒定為層出鐮孢菌，屬于鐮孢霉屬李瑟組。

2.2.2 菌株LD2 的分子鑒定 菌株LD2 的ITS 區(qū)共測(cè)序523 個(gè)堿基，在NCBI 中經(jīng)過(guò)Blast 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)擬輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides）菌株的相似性均達(dá)到99%。系統(tǒng)發(fā)育分析也表明，菌株LD2 與菌株KJ598859.1的親緣關(guān)系最近，與Fusarium 屬其他種類關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)（圖6），結(jié)合該菌株的形態(tài)特征，將其鑒定為擬輪枝鐮孢菌，屬于鐮孢霉屬李瑟組。

2.2.3 菌株LD3 的分子鑒定 菌株LD3 的ITS 區(qū)共測(cè)序526 個(gè)堿基，在NCBI 中經(jīng)過(guò)Blast 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)半裸鐮孢菌（Fusarium incarnatum）菌株的相似性均達(dá)到99%。系統(tǒng)發(fā)育分析也表明，菌株LD3 與菌株KP641161.1 的親緣關(guān)系最近，與Fusarium 屬其他種類關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)（圖7），結(jié)合該菌株的形態(tài)特征，將其鑒定為半裸鐮孢菌，屬于鐮孢霉屬直孢組。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)對(duì)寄生于谷子白發(fā)病菌卵孢子上的真菌進(jìn)行分離純化，共得到3 株重寄生真菌。采用形態(tài)特征和顯微觀察初步確定菌株的分類地位，得出3 株重寄生真菌均屬于鐮孢菌。經(jīng)過(guò)分子鑒定，本試驗(yàn)共分離得到的3 株重寄生真菌LD1，LD2，LD3 分別屬于李瑟組的層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）、擬輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides）和直孢組的半裸鐮孢菌（Fusarium incarnatum），得出了谷子白發(fā)病菌卵孢子上的重寄生真菌主要以鐮孢菌屬為主的結(jié)論，與RAO 等[9]報(bào)道的結(jié)果相符。另外，試驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)，存在叢梗孢屬和地霉屬生長(zhǎng)于谷子白發(fā)病菌卵孢子上的現(xiàn)象，后期的分離純化試驗(yàn)中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與其相關(guān)的菌株，但是并不排除其為重寄生菌的可能性。本研究將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，結(jié)果更加準(zhǔn)確可信。接下來(lái)可以通過(guò)研究3 株重寄生真菌對(duì)于谷種萌發(fā)、谷子生長(zhǎng)發(fā)育等的影響來(lái)確定它們所具有的生防潛力，該結(jié)果將為谷子白發(fā)病的生物防治提供一定的理論依據(jù)。