郭小琴，錢紅梅，郭 星，高佳麗，張義茹，高建華，王興春

（1.山西農業(yè)大學生命科學學院，山西 太谷 030801；2.山西農業(yè)大學農業(yè)生物工程研究所，山西 太谷 030801）

革蘭氏陽性菌蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在自然界中分布廣泛，如在土壤、植物、昆蟲、污水、儲藏物和灰塵中都可以分離得到[1-2]。Bt 能夠表達特異性殺蟲蛋白，包括殺蟲晶體蛋白（insecticidal crystal proteins，ICPs）[3]、營養(yǎng)期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal proteins，VIPs）[4]及分泌型殺蟲蛋白（secreted insecticidal proteins，SIPs）[5]。其中，殺蟲晶體蛋白分為Cry（Crystal Protein，晶體毒素）和Cyt（Cytolitic Protein，細胞裂解素）2 種，而Cry1I 類蛋白是Cry 蛋白家族的一個特殊分支[6-7]，含有 Cry 蛋白典型的 N 端 3 個結構域（I，II 和 III），這3 個結構域具有不同的功能。其中，結構域I 用于形成跨膜通道；結構域II 和III 負責受體的識別與結合[8-10]。

通常，具有經典3 個結構域的Cry 蛋白有2 種大小[6]。其中，一類是在結構域的C 端存在幾乎與之等長的長肽，這類Cry 蛋白的分子量約135 ku，比如Cry1A，Cry9 等；另一類Cry 蛋白不具有C 端長肽，分子量遠小于前者，比如Cry1I 蛋白等，Cry1I 蛋白分子量約81 ku，可以分為7 個亞類（Cry1Ia，Cry1Ib，Cry1Ic，Cry1Id，Cry1Ie，Cry1If 和 Cry1Ig 等），每種亞類中，又包括若干種蛋白，比如Cry1Ia 包括約 38 種已知蛋白（Cry1Ia1～Cry1Ia38）。

Cry1I 是Cry 蛋白中少有的分泌型蛋白，其跨膜分泌由N 端分泌信號肽介導。該蛋白在天然宿主Bt 細胞中表達后，不形成伴孢晶體[11]。

Cry1I 蛋白對鱗翅目和鞘翅目部分昆蟲具有殺蟲活性[12]，具有良好的應用潛力。比如Cry1Ie 蛋白對小菜蛾（Plutella xylostella）[13]、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）[14]、亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）[15]等具有較好的殺蟲活性，表達Cry1Ie 的轉基因煙草[16]、玉米[16]和棉花[17]等也相繼報道。

本研究將一種cry1Ia 基因接入pET28aDel 載體[17]，構建表達質粒，并利用該質粒在大腸桿菌中表達Cry1Ia，旨在對Cry1Ia 蛋白的表達條件進行摸索，并與Bt 細胞的表達進行比較，建立Cry1Ia 蛋白的純化條件，為進一步研究Cry1I 類蛋白奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究涉及的菌株為大腸桿菌（Escherichia Coli）TG1 菌株 Tp304-1Ia 和 Bt 菌株 Bp304-1Ia。2 種菌株均含有 304-P1IaT 質粒[18]。

研究涉及的分子生物學試劑包括：Takara Premix Taq（貨號 RR003A，用于 PCR 反應）、Takara pMD19 載體（貨號 6013，用于 TA 克?。xygen 質粒小量制備試劑盒（貨號AP-MN-P-50）；Axygen DNA 純化回收試劑盒（貨號AP-GX-50）；金斯瑞Ni-NTA 親和層析介質（貨號L00250）。

1.2 試驗方法

1.2.1 表達載體的構建 將Tp304-1Ia 菌株在37 ℃，200 r/min 條件下過夜培養(yǎng)。分別取2 mL 菌液至離心管，12 000 r/min 離心3 min，收集細胞沉淀，并提取質粒，作為PCR 的模板。使用引物1Ia-bbF（5′-GG ATCCACCATGAAACTAAAGAATCAAGATAAG）和1Ia-petR（5′-GCAAGCTTCATGTTACGCTCAATATG GAGTTG）進行PCR 反應，獲得Cry1Ia 的編碼序列，并進行TA-克隆。測序正確后，將目的片段用BamHI和HindIII 切出，接入pET28aDel 質粒相應的位點。將正確的質粒命名為p28D-cry1Ia。將構建好的表達質粒轉入BL21（DE3）star 菌株，獲得BLp28D-cry1Ia 菌株。

1.2.2 Cry1Ia 蛋白的表達與SDS-PAGE 分析 挑取BLp28D-cry1Ia 菌株的單克隆，在液體LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12 h（含 50 μg/L 的卡那霉素，37 ℃，200 r/min）后，按 1∶100（V∶V）的比例轉接至 200 mL 液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.6～1.0。加入終濃度為 1 mmol/L 的 IPTG，在 28 ℃誘導表達 4，8 h。

將上述培養(yǎng)液離心，收集細胞，棄上清。將細胞沉淀用 20 mL 預冷的 PBS 緩沖液（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4和 2 mmol/L KH2PO4，pH 值為 7.4）重懸，超聲波處理 30 min，12 000 r/min 離心20 min，將上清與沉淀分離。將沉淀用等體積的PBS 緩沖液重懸。分別取160 μL 上清和沉淀重懸液，加入 40 μL 的 5×Loading Buffer，混勻后，沸煮 10 min。12 000 r/min 離心 5 min，上樣，進行SDS-PAGE 檢測。

將Bp304-1Ia 菌株劃板，挑取單克隆。在含有25 μg/L 紅霉素的 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 72 h（25 ℃，200 r/min）。取2 mL 菌液離心，分離上清和細胞沉淀。然后制備SDS-PAGE 樣品，并進行電泳分析。

1.2.3 Cry1Ia 蛋白的純化 按照說明書的步驟，將大腸桿菌表達產物的可溶部分，通過Ni-NTA 層析介質，并用含有不同濃度咪唑的洗脫緩沖液依次洗脫，收集穿過液，并進行SDS-PAGE 檢測。

2 結果與分析

2.1 cry1Ia基因的表達載體構建

對p28D-cry1Ia 質粒進行雙酶切（BamHI 和HindIII）鑒定，結果顯示，目的基因大小與304-P1I-aT 質粒中的 cry1Ia 基因相同（BamHI 和 SacI），說明載體構建正確（圖1）。

2.2 Cry1Ia蛋白的表達

在不同的時間點，BLp28D-cry1Ia 均能夠誘導表達Cry1Ia 蛋白，但是，8 h 的表達產物積累更多，尤其是2 號克?。▓D2-A）。SDS-PAGE 結果顯示，Bt 菌株也可表達Cry1Ia 蛋白，但是主要以不可溶的形式表達，上清中未觀察到相應的條帶（圖2-B）。另外，大腸桿菌中的表達產物明顯高于Bt 菌株。

2.3 Cry1Ia蛋白的純化

選擇BLp28D-cry1Ia 菌株2 號克隆的表達產物，取可溶部分使用Ni-NTA 進行純化，結果顯示（圖3），成功純化到Cry1Ia 蛋白，該蛋白在含有60 mmol/L 咪唑的洗脫液中開始從固定相上脫落，但是比例較?。?0 mmol/L 以上的咪唑濃度能夠更好地洗脫Cry1Ia 蛋白，其中，250 mmol/L 的咪唑濃度是Cry1Ia 蛋白的最優(yōu)洗脫濃度。

3 結論與討論

本研究構建了Cry1Ia 蛋白的表達載體，用于在大腸桿菌中表達這種蛋白質，初步研究發(fā)現，在大腸桿菌中該蛋白能夠獲得較好的表達，且隨著表達時間的延長，表達量增加。

Bt 細胞中Cry1Ia 蛋白的產量相對較少。由于Cry1Ia 屬于分泌蛋白，因此，可能有部分表達產物翻譯后分泌至胞外，從而導致細胞內積累較少。Cry1Ia 蛋白分泌后，會迅速被蛋白酶消化，主要以60 ku 抗消化核心的形式存在[12]。因此，要獲得表達量可觀且序列完整的Cry1Ia 蛋白，革蘭氏陰性菌如大腸桿菌是較理想的選擇。

本研究通過對Cry1Ia 蛋白純化條件的摸索，結果發(fā)現，該蛋白在稍低的咪唑濃度（60 mmol/L）下就能夠被洗脫，但此時的非特異性條帶依然較多；而通過稍高濃度咪唑（90，125 mmol/L）的洗脫能夠進一步去雜；利用250 mmol/L 的咪唑能夠將大部分靶標蛋白洗脫。因此，在后期純化時，可以直接用30 mmol/L 的咪唑充分洗脫去雜；然后用90 mmol/L的咪唑進一步洗脫去雜；最后用250 mmol/L 的咪唑收集Cry1Ia 蛋白。

本研究構建了Cry1Ia 蛋白的表達體系，并探索了該蛋白的純化條件，為進一步研究這類殺蟲蛋白奠定了基礎。