孫依帆　牛歡　馮靜云　黃建國(guó)　張露露　張超群　范寶莉　劉曉穎　王振英

摘 ? ?要：WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在植物抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。本研究以抗白粉病小麥Brock為材料，從中克隆到一個(gè)WRKY基因，該基因全長(zhǎng)1 485 bp，預(yù)測(cè)ORF長(zhǎng)1 392 bp，編碼463個(gè)氨基酸，分子量為49.8 kDa。經(jīng)NCBI/Blastx比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與粗山羊草中WRKY26基因（序列號(hào)XP_020151406）所編碼的轉(zhuǎn)錄因子同源性高達(dá)98%，故將其命名為TaWRKY26，并將擴(kuò)增得到的序列全長(zhǎng)上傳至GenBank進(jìn)行登記，序列號(hào)為MK358190。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)白粉菌脅迫后TaWRKY26在不同抗性小麥品種（抗病小麥Brock，感病小麥京411，抗病近等基因系Brock/京4117）中不同時(shí)間（0，2，4，8，12，24，48，72，120，168 h）的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在受到白粉菌侵染后，3個(gè)品種小麥的TaWRKY26表達(dá)量除12和72 hpi外，各時(shí)間段均表現(xiàn)為抗病小麥Brock>近等基因系Brock/京4117>感病小麥京411，抗白粉病小麥近等基因系Brock/京4117（抗?。┲蠺aWRKY26表達(dá)趨勢(shì)更偏向抗病親本Brock。綜合推測(cè)TaWRKY26在小麥對(duì)白粉菌侵染的應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了積極作用。

關(guān)鍵詞：TaWRKY26基因;小麥;白粉病;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

中圖分類號(hào)： S512.1 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.04.002

Cloning of Wheat TaWRKY26 Gene and Its Function Analysis in Powdery Mildew Resistance

SUN Yifan， NIU Huan， FENG Jingyun， HUANG Jianguo， ZHANG Lulu， ZHANG Chaoqun， FAN Baoli， LIU Xiaoying， WANG Zhenying

（College of Life Science， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）

Abstract： ?The WRKY family plays an important role in the stress tolerance mechanism of plants. In this experiment， a gene of WRKY was cloned from the powdery mildew disease resistant wheat Brock. The gene contained a 1 392 bp ORF， and 463 amino acids with a predicted molecular weight of 49.8 kDa. The NCBI/Blastx alignment showed that this gene had 98% homology to the transcription factor encoded by the WRKY26 gene（SEQ ID： XP_020151406） in Aegilops tauschii， so we named it TaWRKY26. The full length of the amplified sequence was uploaded to GenBank for registration， and the accession number was MK358190. The expression patterns of TaWRKY26 in different resistant wheat[disease resistant wheat Brock， susceptible wheat variety Jing411， and Near-isogenic Lines Brock/Jing 4117（NILs）] after infected by powdery mildew were studied through real-time fluorescent quantitative PCR， the expression quantity at different time （0， 2， 4， 8， 12， 24， 48， 72， 120， 168 h） was analyzed. After infected by powdery mildew， the expression quantity of TaWRKY26 at 0， 2， 4， 8， 24， 48， 120， 168 h were all shown as follows： Brock>NILs >Jing411，and the expressive trend in NILs was more closer to disease resistant wheat Brock， indicating that TaWRKY26 participated in the interaction of wheat and powdery mildew.

Key words： TaWRKY26 gene; wheat; powdery mildew; RT-qPCR

小麥作為當(dāng)今世界重要糧食作物之一，保證其產(chǎn)量對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著重要的意義。小麥產(chǎn)量容易受到各種病原體侵害的影響，其中，白粉病是危害最大的病害之一，白粉病流行會(huì)造成小麥減產(chǎn)30%[1]。

植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，形成了各種抵抗自然環(huán)境不利因素的抗性機(jī)制，主要分為分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)（Pattern-triggered immunity，PTI）和效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity，ETI）[2-3]。植物受到病原菌侵染時(shí)會(huì)誘發(fā)PTI反應(yīng)，使植物發(fā)生一系列的變化，如Ca2+外流、激活下游信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated proteinkinase，MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)等[4-5]。

在植物MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中有一類植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子——WRKY家族[6-7]。WRKY家族已在很多的植物、農(nóng)作物中被分離鑒定出來(lái)，對(duì)其功能進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)WRKY基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆境脅迫過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用。樟樹中發(fā)現(xiàn)的WRKY基因參與單萜類化合物芳樟醇的合成[8];在栗和狗尾巴草中發(fā)現(xiàn)WRKY基因?qū)Ψ巧锩{迫和激素信號(hào)有較強(qiáng)的響應(yīng)[9];香蕉中MaWRKY26基因參與香蕉對(duì)冷脅迫的響應(yīng)[10];棉花WRKY 基因?qū)}、甘露醇和ABA脅迫均有響應(yīng)[11]。WRKY家族不僅在抗非生物脅迫中起到重要作用，在植物抗病原菌的過(guò)程中，也起到了至關(guān)重要的作用。擬南芥中的AtWRKY33通過(guò)直接抑制ABA的表達(dá)水平來(lái)提高對(duì)灰霉病菌的抵抗作用[12];葡萄中的VvWRKY1過(guò)表達(dá)能夠顯著地提高對(duì)霜霉病的抗性[13];煙草中的WRKY基因沉默后植株對(duì)灰霉病的易感性增加[14]。

王振英教授實(shí)驗(yàn)室對(duì)白粉菌脅迫栽培小麥Brock的早期應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)抗病通路的基因出現(xiàn)表達(dá)差異，其中包括MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的基因片段F5;通過(guò)Blastx比對(duì)發(fā)現(xiàn)F5與粗山羊草中WRKY26基因（序列號(hào)XP_020151406）所編碼的轉(zhuǎn)錄因子的同源性高達(dá)98%，與普通小麥中的TaWRKY2同源性也高達(dá)95%（序列號(hào)ACD80357）。目前，對(duì)植物WRKY26和TaWRKY2基因的研究多集中在植物抗逆和生長(zhǎng)發(fā)育方面，尚未見到關(guān)于小麥WRKY26基因在抗白粉病方面的研究報(bào)道。

本課題組為了分析F5基因與抗白粉病的相關(guān)性，根據(jù)相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物對(duì)其全長(zhǎng)進(jìn)行了克隆，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同抗性小麥在受白粉菌脅迫的條件下該基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，希望能夠闡述WRKY26基因的功能，為其在小麥分子育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

白粉病抗性品種小麥Brock，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)楊作民教授惠贈(zèng)。

白粉病感性品種小麥京411，由王振英教授實(shí)驗(yàn)室保存。

白粉病抗性雜交品種近等位基因系Brock×京4117（Near-Isogenic Lines，NILs），是王振英教授實(shí)驗(yàn)室早期以抗白粉病栽培小麥Brock為抗病基因供體，以感病品種京411為輪回親本，通過(guò)雜交獲得F1，然后再以京411進(jìn)行連續(xù)回交，每一代都在白粉菌選擇壓力下，選取抗病性狀明顯的單株，持續(xù)回交、選擇6代后，再自交一代獲得的抗病近等基因系。Brock×京4117在農(nóng)藝性狀上偏輪回親本京411，抗白粉病性狀偏供體親本Brock。

小麥白粉菌15號(hào)生理小種，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，用于對(duì)小麥材料進(jìn)行脅迫。

1.2 TaWRKY26基因克隆

利用Promega公司的EastepR ? ? ? Super Total RNA Extraction Kit提取Brock小麥的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop1000檢測(cè)RNA的質(zhì)量以及濃度。然后以O(shè)ligo （d T）18為引物，利用Promega公司的M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Blastx比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)WRKY基因引物（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：5×PSGXL Buffer 5 μL，dNTP Mix 2 μL，WRKY-F 0.5 μL，WRKY-R 0.5 μL，cDNA1 μL，PrimeSTARR ? ? ? ?Max DNA Polymerase 0.5 μL，滅菌水15.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，68 ℃延伸2 min，反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán);68 ℃終延伸7 min。將目標(biāo)條帶進(jìn)行切膠回收，加A尾，連接到pGEM-T easy Vector上。將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，選取陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。

1.3 序列分析

將測(cè)序結(jié)果提交 NCBI GenBank進(jìn)行同源性分析。用APE軟件進(jìn)行基因序列分析和拼接，同DNAMAN進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4 白粉菌脅迫下TaWRKY26表達(dá)模式分析

為了探究目標(biāo)基因與小麥抗白粉病特性之間的關(guān)系，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)白粉菌脅迫下小麥中的目標(biāo)基因進(jìn)行表達(dá)模式分析。在相同且適宜的條件下培養(yǎng)Brock、京411和NILs小麥，待材料第一片葉完全打開時(shí)，以抖拂法將白粉菌15號(hào)生理小種的分生孢子均勻的接種在小麥葉片上，接種0，2，4，8，12，24，48，72，120，168 h后，取相同部位的葉片，用1.2中所述方法提取葉片的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將所得cDNA用于表達(dá)模式分析。

根據(jù)所擴(kuò)增TaWRKY26片段設(shè)計(jì)特異的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物qWRKY（表1），所擴(kuò)增片段長(zhǎng)127 bp，用Promega公司的EastepRqPCR Master Mix在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems上進(jìn)行基因擴(kuò)增、熒光信號(hào)檢測(cè)和溶解曲線分析（此步驟為儀器自動(dòng)進(jìn)行）。小麥Actin基因作為內(nèi)參基因，引物序列詳見表1。所用程序?yàn)椋?0 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性10 min;95 ℃變性15 s，58 ℃延伸30 s，反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。將所得數(shù)據(jù)用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[15]。選用京411小麥0 h葉片中TaWRKY26表達(dá)量作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaWRKY26基因的克隆

提取白粉菌侵染24 h的Brock葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后用于基因擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，在1 500 bp位置有一明顯條帶，將該條帶克隆、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果（圖2）顯示，該片段長(zhǎng)1 485 bp，與片段F5進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)包含F(xiàn)5片段;預(yù)測(cè)開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）長(zhǎng)1 392 bp，編碼463個(gè)氨基酸，分子量為49.8 kDa;通過(guò)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列具有兩個(gè)WRKY基因的典型結(jié)構(gòu)域：WRKYGQK結(jié)構(gòu)。

2.2 多序列比對(duì)分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

利用DNAMAN軟件對(duì)TaWRKY26與針茅（Stipa purpurea，Sp）、黍（Panicum hallii，Ph）、粗山羊草（Aegilops tauschii，At）和小麥（Triticum aestivum，Ta）中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族其他基因進(jìn)行多序列比對(duì)分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，TaWRKY26與這些基因均具有較高同源性。進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，TaWRKY26與粗山羊草中WRKY26基因親緣關(guān)系最近，與小麥中的TaWRKY2次之，這一比對(duì)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期工作中的Blastx比對(duì)結(jié)果一致，故將其命名為TaWRKY26，并將擴(kuò)增得到的序列全長(zhǎng)上傳至GenBank進(jìn)行登記，序列號(hào)為MK358190。

2.3 白粉菌脅迫下TaWRKY26表達(dá)模式分析

為了驗(yàn)證TaWRKY26是否參與小麥抗白粉病過(guò)程，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分別分析白粉菌侵染不同時(shí)間段TaWRKY26基因在不同抗性小麥中表達(dá)量趨勢(shì)變化。由圖5可知，在感病小麥京411中，白粉菌侵染后，TaWRKY26基因表達(dá)量呈升高-降低-升高-降低-升高的波動(dòng)變化趨勢(shì)，至12 hpi 時(shí)達(dá)到高峰，為對(duì)照的4.2倍，至168 hpi與對(duì)照組（京411 0 hpi）接近;在抗病小麥Brock中，TaWRKY26基因表達(dá)量亦呈升高-降低-升高-降低-升高-降低-升高的波動(dòng)變化趨勢(shì)，除12 hpi外，在其他各時(shí)間點(diǎn)均高于同時(shí)期感病小麥京411，通過(guò)多重比較發(fā)現(xiàn)，在0，24，72，120 hpi時(shí)表達(dá)量差異顯著（P<0.05），2，168 hpi時(shí)表達(dá)量差異極顯著（P<0.01），且在24 hpi表達(dá)量最高，為Brock葉片0 hpi時(shí)的2.9倍，對(duì)照組（京411 0 hpi）的13.2倍;在抗病小麥NILs中，受白粉菌侵染后，TaWRKY26表達(dá)量呈降低-升高-降低-升高-降低-升高-降低的波動(dòng)變化趨勢(shì)，在24 hpi時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，為NILs葉片0 hpi時(shí)的2.0倍，對(duì)照組（京411 0 hpi）的5.6倍，NILs中TaWRKY26的表達(dá)變化介于感病小麥京411和抗病小麥Brock之間，但更趨向于抗病親本Brock。

3 結(jié)論與討論

植物在受到逆境脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生一系列的抗逆反應(yīng)，這些抗逆反應(yīng)受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，同時(shí)一種轉(zhuǎn)錄因子能響應(yīng)多種抗逆反應(yīng)，即一因多效。WRKY轉(zhuǎn)錄因子最早是從甘薯中克隆出來(lái)的[16]。后來(lái)在多種植物中克隆到了WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族并對(duì)其功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)WRKY家族多參與植物抗逆、生物脅迫和衰老等過(guò)程。在小麥中，多個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子已被證實(shí)參與了小麥抗逆反應(yīng)：吳華玲等[17]發(fā)現(xiàn)TaWRKY10、TaWRKY19-a、TaWRKY71和TaWRKY72-b可能是小麥抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的交流因子;還有研究發(fā)現(xiàn)，TaWRKY46能夠提高小麥植株的抗氧化能力[18];TaWRKY35過(guò)表達(dá)的小麥植株耐鹽性會(huì)顯著提高[19]。

在植物對(duì)白粉菌的響應(yīng)中，WRKY基因也發(fā)揮著重要的作用，在大麥中沉默HvWRKY10、HvWRKY19和HvWRKY28后其對(duì)白粉菌的易感性顯著上升，而將這3個(gè)基因瞬時(shí)過(guò)表達(dá)后能夠正向調(diào)控大麥對(duì)白粉菌的響應(yīng)[20];在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的WRKY18和WRKY40會(huì)抑制植株對(duì)白粉病的響應(yīng)[21];小麥中TaWRKY34在抗白粉病近等基因系中受白粉病菌誘導(dǎo)后表現(xiàn)出了上調(diào)趨勢(shì)，證明TaWRKY34可能參與了對(duì)白粉菌的防衛(wèi)應(yīng)答反應(yīng)[22];MdWRKY40b長(zhǎng)時(shí)間高量表達(dá)可能是導(dǎo)致富士蘋果易感白粉病的主要原因之一[23]。上述試驗(yàn)都表明WRKY基因參與植物對(duì)白粉菌脅迫的響應(yīng)。

目前，有關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究均顯示W(wǎng)RKY26基因可能與植物抗逆密切相關(guān)。擬南芥中WRKY26基因能夠提高植株的耐熱性[24];葡萄中WRKY26基因可能應(yīng)答多種植物逆境脅迫相關(guān)信號(hào)[25]等。本試驗(yàn)克隆到的TaWRKY26具有兩個(gè)典型的WRKYGQK結(jié)構(gòu)，經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)與粗山羊草中WRKY26基因同源性最高;從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出小麥中與TaWRKY26同源性最高的基因?yàn)門aWRKY2。TaWRKY2在植物中多參與抗逆應(yīng)答反應(yīng)，如將TaWRKY2過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和耐旱性均顯著提高[26];將TaWRKY2轉(zhuǎn)入短柄草中，在室溫條件下能夠提高短柄草對(duì)赤霉病的抵抗性[27];在小麥中過(guò)表達(dá)TaWRKY2，小麥的耐旱性顯著提高[28]。說(shuō)明小麥中的TaWRKY2基因參與植物耐鹽、耐干旱及對(duì)赤霉病的應(yīng)答，TaWRKY26與粗山羊草中WRKY26基因和小麥TaWRKY2基因均有較高同源性，可推斷其可能在小麥-白粉菌互作過(guò)程中發(fā)揮重要功能。

前期工作中發(fā)現(xiàn)栽培小麥Brock中含有一個(gè)抗白粉病新基因，且由顯性單基因控制[29]，但Brock與我國(guó)大多數(shù)栽培小麥花期不遇，故利用Brock進(jìn)行小麥抗白粉病育種工作進(jìn)展緩慢，在Brock中開展抗病基因的相關(guān)研究對(duì)生產(chǎn)上合理利用該品種資源有重要意義。小麥抗白粉病近等基因系是進(jìn)行小麥抗白粉病遺傳機(jī)制研究的寶貴材料，理論上，近等基因系與輪回親本遺傳背景相似，僅有一對(duì)抗病基因的差別，本研究通過(guò)對(duì)TaWRKY26表達(dá)模式進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量在抗病小麥Brock中除12 hpi外均高于感病小麥京411，在抗白粉病小麥近等基因系Brock/京4117（抗?。┲薪橛诟胁∮H本京411和抗病親本Brock之間，且更偏向抗病親本Brock，說(shuō)明TaWRKY26受Brock中抗白粉病基因的正調(diào)控作用，可能參與小麥的抗白粉病應(yīng)答反應(yīng)，在小麥對(duì)白粉菌侵染的應(yīng)答通路中起到一定的作用。

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