劉彥妮 楊文文 王華忠

摘 ? ?要：自噬參與了動植物的生長、發(fā)育、衰老和逆境脅迫響應等過程。NBR1是選擇性自噬的底物受體之一，其識別泛素化的特定蛋白底物并通過與自噬膜上的ATG8互作引導底物進入自噬降解過程。在前期克隆了兩個小麥NBR1基因的基礎上，本研究通過常規(guī)的分子克隆技術構建了兩個基因的原核表達載體并將其轉化到大腸桿菌中，利用SDS-PAGE方法鑒定了兩個NBR1基因在大腸桿菌中的表達情況。結果表明，導入大腸桿菌的兩個小麥NBR1均能夠被IPTG誘導表達;表達重組蛋白兩端含有His（6）標簽，其表觀分子量與理論分子量基本一致;重組蛋白在誘導后2 h即表現(xiàn)較高的表達量，并在誘導后4 h達到最高的表達量。研究結果為后續(xù)小麥NBR1蛋白的純化、抗體的制備以及該蛋白的互作性質、表達特征等功能研究工作奠定了基礎。

關鍵詞：選擇性自噬;小麥;NBR1基因;原核表達

中圖分類號：S512.1 ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.04.001

Prokaryotic Expression of The Wheat Key Selective Autophagy Gene NBR1

LIU Yanni， YANG Wenwen， WANG Huazhong

（Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， School of Life Sciences， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）

Abstract： Autophagy plays an important role in the growth， development， aging and stress responses of plants and animals. NBR1 functions in selective autophagy as a substrate receptor， which recognizes specific ubiquitinated proteins and presents them to the autophagic degradation process through its interaction with ATG8 on autophagic membranes. Previously， two wheat NBR1 genes were cloned in Tianjin key laboratory of animal and plant resistance. In this study， prokaryotic expression vectors for the two wheat NBR1s were constructed and transformed into E. coli. Results from SDS-PAGE showed that wheat NBR1s could express efficiently in E. coli through IPTG induction. The expressed recombinant proteins had N- and C- terminal His（6） tags， and their molecular weights were consistent with the predicted values. High levels of recombinant proteins were detected at as early as 2 h after IPTG induction， and the highest levels were reached at 4 h after IPTG induction. These results laid a foundation for the preparation of recombinant wheat NBR1 proteins and their antibodies for use in assays on the interaction and expression features of wheat NBR1s.

Key words： selective autophagy; wheat （Triticum aestivum L.）; NBR1gene; prokaryotic expression

自噬（autophagy）是一種保守的真核生物細胞內物質降解過程。在自噬過程中，細胞質物質被雙層膜結構的自噬小體包裹，隨后經(jīng)自噬小體外膜與液泡或溶酶體膜的融合過程以內膜包裹的形式（此時稱為自噬小泡）進入液泡或溶酶體腔中進行降解，降解產生的小分子可以作為營養(yǎng)物質重新利用[1]。自噬過程的執(zhí)行依賴于多種自噬相關因子ATG（AuTophaGy-related factor）的參與[1]。ATG8蛋白定位于自噬膜表面，在自噬小體的組裝及其與溶酶體/液泡膜的融合過程中發(fā)揮重要作用[2-4]。自噬分為批量自噬和底物特異性的選擇性自噬，ATG8在選擇性自噬的底物捕獲過程中也發(fā)揮了重要作用[1]。自噬膜表面的ATG8通過直接與特異性底物互作或與其受體互作的方式將底物捕獲到自噬小體中[5]。NBR1（Neighbor of BRCA1 gene 1）是目前鑒定到的重要選擇性自噬底物受體/ATG8互作蛋白之一。NBR1含有泛素結合結構域和ATG8互作結構域，其一方面識別并結合泛素化蛋白，另一方面通過與ATG8的互作將其識別的底物引導進入自噬小體[6]。動物上有關NBR1研究的報道較多，發(fā)現(xiàn)其參與了蛋白質聚集體自噬[6]和過氧化物酶體自噬[7]過程的底物識別。植物NBR1先后在擬南芥[8]和煙草（稱為Joka2）[9]上得到鑒定，證實了其與ATG8和泛素化蛋白質底物的互作，參與了脅迫條件下泛素化蛋白質聚集體和入侵病毒相關蛋白的選擇性自噬過程[9-13]。到目前為止，重要農作物小麥上還未見有關選擇性自噬和NBR1研究的報道。

本研究在前期克隆了小麥兩個NBR1基因TaNBR1-1和TaNBR1-2的基礎上，構建了兩個基因的原核表達載體，實現(xiàn)了兩個基因編碼蛋白在大腸桿菌中的誘導表達，為后續(xù)小麥NBR1蛋白的純化、抗體的制備和該蛋白的互作性質、表達特征等功能研究工作奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 基因、載體及試劑

克隆于質粒載體上的兩個小麥NBR1基因TaNBR1-1和TaNBR1-2（均為全長cDNA）和原核表達載體pET30a由天津市動植物抗性重點實驗室保存。實驗用高保真DNA聚合酶primeSTAR、普通Taq酶、限制性內切酶（EcoRⅠ、BamHⅠ和XhoⅠ）以及大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）菌株感受態(tài)細胞均為TakaRa公司產品;快速連接試劑盒（LigaFast）購自Promega公司;引物合成委托北京六合華大基因科技有限公司完成;其他試劑均為國產分析純。

1.2 原核表達載體的構建

設計合成用于擴增TaNBR1-1基因完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）的引物對NBR1-F（GCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGTCCGGCCTGA

GCGCG）/NBR1-R（GTG GTGGTGGTGGTGCTCGAG

CTTGTCCTTCTTCTCCCTGGC）和擴增TaNBR1-2基因完整ORF的引物對NBR2-F（GCCATGGCTGATA

TCGGATCCATGATGCCTCAACGGGACAC）/ NBR2-R（GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCATCAGTTCCTTCA

GCTCCGC），擴增片段兩端能夠帶上EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點（TaNBR1-1）或BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點（TaNBR1-2）。使用引物對和高保真DNA聚合酶primeSTAR，分別以克隆有兩個TaNBR1基因的質粒為模板進行PCR擴增。對擴增片段進行EcoRⅠ/XhoⅠ或BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，對載體pET30a質粒進行相應的雙酶切。使用快速連接試劑盒（LigaFast）連接片段和載體。連接產物轉化大腸桿菌DH5α后，使用菌落PCR和酶切方法鑒定重組克隆即目標基因的表達載體。鑒定到的表達載體經(jīng)測序進行進一步確認。采用熱激法將表達載體導入到大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）中。

1.3 原核表達

接種含有表達載體質粒的大腸桿菌BL21（DE3）到2 mL含50 mg·L-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)過夜。按1 % 的比例擴大到10 mL 相同的液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（3 h左右）。加入終濃度為0.5 mmol L-1的IPTG，于28 ℃條件下震蕩培養(yǎng)誘導目標基因的表達。分別于誘導后0，2，4，6，8 h取1 mL菌液用于總蛋白的SDS-PAGE電泳分析。

1.4 SDS-PAGE電泳

將收集的1 mL菌液于10 000 rpm條件下離心10 min，倒掉上清，用80 μL的ddH2O重懸沉淀，再加入20 μL的5倍上樣緩沖液并混勻，沸水浴10 min裂解細胞變性蛋白。將裂解液于12 000 rpm條件下離心5 min，取20 μL上清進行SDS-PAGE電泳（12 % 分離膠，4 % 濃縮膠）。電泳后用考馬斯亮藍R-250染色液染色1 h，脫色液脫色至背景無色后觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 兩個小麥NBR1基因原核表達載體的構建

TaNBR1-1基因原核表達載體的構建流程如圖1A所示，設計合成5端分別添加了EcoRⅠ和XhoⅠ位點的正、反向引物，使用該引物對并以克隆有TaNBR1-1全長cDNA的質粒為模板進行PCR擴增獲得兩端添加了相應酶切位點的TaNBR1-1基因ORF片段，對ORF片段和pET30a載體進行EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切和連接，連接產物轉化大腸桿菌后通過菌落PCR方法初步鑒定重組克隆。隨后的EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定結果（圖1B）表明，重組載體能夠正確切出5 422 bp 的載體片段和2 613 bp的插入基因片段。重組載體經(jīng)測序得到進一步確認，表明TaNBR1-1基因的原核表達載體構建成功，并將其命名為pET-TaNBR1-1。

TaNBR1-2基因原核表達載體的構建流程與TaNBR1-1基因類似，不同的是酶切位點選擇的是BamHⅠ和XhoⅠ。BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定結果（圖1C）表明，構建的重組載體能夠正確切出5 422 bp 的載體片段和2 538 bp的插入基因片段。重組載體經(jīng)測序得到進一步確認，表明TaNBR1-2基因的原核表達載體構建成功，并將其命名為pET-TaNBR1-2。

2.2 小麥TaNRB1-1基因的原核表達

將導入pET-TaNBR1-1載體質粒的大腸桿菌BL21（DE3）接種到LB培養(yǎng)基中并在28 ℃條件下進行震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加了0.5 mmol·L-1 IPTG誘導目的基因的表達。于誘導后不同時間取1 mL菌液提取總蛋白進行SDS-PAGE分析（圖2）。結果表明，誘導0 h的總蛋白中無目標重組蛋白條帶，而經(jīng)IPTG 誘導2 h后的總蛋白中出現(xiàn)兩端融合組氨酸標簽的His（6）-TaNBR1-1-His（6）重組蛋白條帶，其表觀分子量與理論分子量（101.6 kDa）基本一致。重組蛋白在誘導后2 h即表現(xiàn)較高的表達量，并在誘導后4 h達到最高的表達量。

2.3 小麥TaNRB1-2基因的原核表達

經(jīng)IPTG誘導，導入大腸桿菌的TaNBR1-2基因也能正常表達出兩端融合組氨酸標簽的重組蛋白His（6）-TaNBR1-2- His（6），但表達量不高（圖3）。重組蛋白在誘導2 h后開始出現(xiàn)，至誘導后4 h達到最高的表達量。重組蛋白的表觀分子量稍大于理論分子量（97.28 kDa）。

3 結論與討論

自噬過程的分子機制和生理功能是近年來生命科學的熱點研究領域。NBR1是選擇性自噬的重要底物識別蛋白之一。NBR1參與的選擇性自噬與植物抵抗細菌[14]、卵菌[15-16]和病毒[12-13]的侵染密切相關，也與植物耐受高溫、氧化、干旱和高鹽等逆境脅迫密切相關[10]。圍繞NBR1功能研究的核心內容是其與多種蛋白的互作機制（自身互作形成二聚體，與底物互作，與ATG8互作和與細胞骨架互作等）及這種互作的生理意義。開展pull-down、免疫共沉淀等蛋白質互作實驗離不開目標蛋白的原核表達、純化和相應抗體的制備。在選擇性自噬過程中，NBR1與被其識別的底物蛋白一起進入自噬小體并最終在液泡中被降解。因此，細胞內NBR1的降解情況即NBR1的蛋白水平可以作為一個指標用于監(jiān)測細胞內自噬流的強度，NBR1蛋白水平的下降預示著自噬流強度的上升[17-18]。此類依賴western雜交方法的蛋白質水平鑒定也需要利用原核表達的重組蛋白制備相應的抗體。目前植物NBR1的功能研究主要集中在模式物種擬南芥上，在圍繞擬南芥NBR1的互作機制和基于該蛋白的自噬流強度監(jiān)測研究的關鍵實驗中都涉及該蛋白抗體的制備和使用[8，13-14，19]。

本實驗室前期在重要農作物小麥上克隆了兩個NBR1基因，正在對這兩個基因及其參與的選擇性自噬過程的生理功能開展深入研究。本研究構建了兩個小麥NBR1基因的原核表達載體，實現(xiàn)了兩個基因在大腸桿菌中的誘導表達，產生的兩端融合His（6）標簽的重組蛋白分子量與理論值基本一致。His（6）標簽的存在方便了重組蛋白的純化工作;誘導表達的時間規(guī)律分析確定了兩個基因在誘導后4 h即可以達到最高的表達量。研究結果可為后續(xù)小麥NBR1蛋白的純化、抗體的制備和該蛋白的互作性質、表達特征等功能研究工作奠定了基礎。

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