封夢(mèng)娟,楊正標(biāo),張 芹,宋寧慧,劉艷華,郭瑞昕,陳建秋*,張圣虎*

(1. 中國(guó)藥科大學(xué)工學(xué)院, 江蘇 南京 211198; 2. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇 南京 210042; 3. 南京市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站, 江蘇 南京 210013)

藥物及個(gè)人護(hù)理品(PPCPs)作為一類(lèi)新型污染物因其在環(huán)境中的殘留和潛在危害引起了各國(guó)環(huán)境學(xué)者的廣泛關(guān)注[1-7]?？股厥且活?lèi)常見(jiàn)的PPCPs類(lèi)物質(zhì),已經(jīng)被廣泛用于人類(lèi)和動(dòng)物治療，以及預(yù)防細(xì)菌、致病微生物感染的疾病中,同時(shí)也被作為促生長(zhǎng)藥物廣泛用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[8-11]。近年來(lái)抗生素被大量頻繁使用,在天然水體、沉積物、水生生物、土壤等環(huán)境介質(zhì)中被廣泛檢出[12-17],濃度水平多在痕量級(jí)別(ng/L～μg/L)。抗生素可在較低水平下對(duì)病原菌產(chǎn)生作用,因此會(huì)使耐藥菌在環(huán)境中被誘發(fā)和散播,嚴(yán)重干擾生態(tài)環(huán)境,進(jìn)而給人類(lèi)健康帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)[17-19]。

抗生素種類(lèi)繁多,目前還沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)用于環(huán)境樣品中多種抗生素的分析,現(xiàn)有的分析方法主要包括薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜-紫外/熒光法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[20-26]。唐慧玲和尹鴻萍[20]利用薄層色譜-生物自顯影聯(lián)用原位技術(shù)檢測(cè)農(nóng)副產(chǎn)品中的抗生素殘留,結(jié)果表明100份樣品中有72份檢出抗生素殘留;王寧[21]建立了大體積樣品堆積-區(qū)帶毛細(xì)管電泳同時(shí)分離測(cè)定水產(chǎn)品中氟喹諾酮類(lèi)和磺胺類(lèi)抗生素的方法,檢出限為13～33 μg/L;韓敏奇等[22]采用酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)長(zhǎng)江原水中四環(huán)素的含量,結(jié)果表明其含量均小于檢出限;王橋軍等[23]采用固相萃取-高效液相色譜-熒光法測(cè)定水中喹諾酮類(lèi)抗生素含量,4種目標(biāo)化合物的檢出限為0.083～0.248 g/L。上述4種方法僅能滿(mǎn)足定性篩查,以及定量分析種類(lèi)和數(shù)量較少的環(huán)境樣品中抗生素的含量。然而在實(shí)際抗生素污染監(jiān)測(cè)中,污染對(duì)象具有很大的不確定性,因此開(kāi)發(fā)多類(lèi)別多種抗生素快速準(zhǔn)確的分析方法就顯得尤為重要。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),已經(jīng)越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于抗生素分析中。楊常青等[24]采用正、負(fù)離子同時(shí)掃描模式建立了固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)河流水體中4類(lèi)16種抗生素的定量分析;杜鵑等[25]建立了固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)水中6類(lèi)23種抗生素的分析方法,并將其應(yīng)用于海水中抗生素殘留的分析中。

本研究采用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),建立了地表水中5類(lèi)(磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和青霉素類(lèi))40種抗生素同時(shí)定量的分析方法,應(yīng)用本方法對(duì)長(zhǎng)江南京段16個(gè)地表水點(diǎn)位進(jìn)行抗生素污染篩查。該法可為深入了解我國(guó)區(qū)域水環(huán)境中抗生素的賦存水平提供數(shù)據(jù),也可為環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC: 1 290 Infinity,美國(guó)Agilent公司;MS: QTRAP 4 500,美國(guó)AB SCIEX公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-300,瑞士Buchi公司);萃取小柱(Oasis HLB,美國(guó)Waters公司);電子天平(AG-285,瑞士Mettle公司);超純水儀(Milli-Q,美國(guó)Millipore公司);送風(fēng)定溫干燥箱(WF0-700W,上海愛(ài)郎儀器有限公司)。

甲醇和乙腈(色譜純,德國(guó)Merck公司);甲酸和氨水(色譜純,國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)、磷酸和二氫鈉磷酸(分析純,南京化學(xué)試劑有限公司)。

40種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品包括(1)磺胺類(lèi)(SAs):乙?；前?SA)、磺胺吡啶(SNM)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺甲嘧啶(SMZ)、磺胺甲二唑(SMT)、苯甲?；前?SBD)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(SMD)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(SD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺間二甲氧嘧啶鈉(SDM)、磺胺噻唑(ST)、甲氧芐啶(TRI)、磺胺二甲異唑(SOX)和磺胺甲氧噠嗪(SPD); (2)喹諾酮類(lèi)(FQs):諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、洛美沙星(LOM)、恩諾沙星(ERX)、依諾沙星(ENX)、麻保沙星(MBX)、氟羅沙星(FLX)、氧氟沙星(OFX)和培氟沙星(PFLX); (3)四環(huán)素類(lèi)(TCs):土霉素(OXY)、金霉素(CTE)、四環(huán)素(TCY)、土霉素(MET)和強(qiáng)力霉素(DOX); (4)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(MAs):阿奇霉素(AZM)、羅紅霉素(ROX)、螺旋霉素(SPI)、克林霉素(CLI)、克拉霉素(CLR)、林可霉素(LIN)、泰樂(lè)菌素(TLS)和紅霉素(ERY); (5)青霉素類(lèi)(Pen):青霉素G(PEN G)和氨芐西林(AMP),以上均購(gòu)自百靈威科技有限公司,純度均大于99.0%。

上述標(biāo)準(zhǔn)品均用甲醇配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,并用甲醇配制成20 mg/L的40種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。使用時(shí),用甲醇稀釋至所需濃度。

1.2 樣品的采集

2018年8月,沿長(zhǎng)江南京段設(shè)置16個(gè)采樣點(diǎn)(S1～S16),采集表層(0～1 m)水體水樣,每個(gè)采樣點(diǎn)一次性采集1 L,置于棕色玻璃瓶中,運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 提取和凈化

用量筒準(zhǔn)確移取1 L水樣,經(jīng)0.45 μm玻璃纖維濾膜過(guò)濾除雜后,添加5 mL 100 g/L的EDTA·Na2溶液,用50%(v/v)磷酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0左右,然后以4 mL/min的流速通過(guò)Oasis HLB小柱進(jìn)行固相萃取。上樣前,依次用6 mL甲醇、3 mL超純水、6 mL 100 g/L磷酸二氫鈉溶液活化小柱。上樣后,用6 mL超純水淋洗,棄去淋洗液,負(fù)壓抽干30 min以上,再依次用6 mL甲醇、6 mL 2%(v/v)氨水甲醇溶液洗脫,且保持洗脫流速為1 mL/min。將洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干,用甲醇復(fù)溶至1 mL,待HPLC-MS/MS分析。

1.4 分析條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:A為0.2%(v/v)甲酸水溶液,B為乙腈;流速:0.3 mL/min。流動(dòng)相洗脫梯度:0～5 min, 99%A～90%A; 5～25 min, 90%A～50%A; 25～26 min, 50%A～99% A; 26～30 min, 99%A。進(jìn)樣體積:5 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;離子源溫度:550 ℃;多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式;離子噴霧電壓:5 500 V;氣簾氣(CUR)壓力:35.0 kPa;噴霧氣(GS1)壓力:60.0 kPa;輔助加熱氣(GS2)壓力:65.0 kPa。40種抗生素的其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 40種抗生素的母離子、子離子、碰撞能量(CE)、去簇電壓(DP)、射入電壓(EP)和碰撞室射出電壓(CEP)

表 1 (續(xù))

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)5類(lèi)抗生素分子結(jié)構(gòu)中的基團(tuán)特征,同時(shí)參考相關(guān)文獻(xiàn)[25,27],最終選擇ESI+模式進(jìn)行掃描,在MRM模式下進(jìn)行監(jiān)測(cè)。采用半自動(dòng)的質(zhì)譜進(jìn)樣方式,將40種100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別注入離子源,流速為5 μL/min。

質(zhì)譜分析單個(gè)抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),選取響應(yīng)最高的離子峰作為該物質(zhì)的母離子(定量離子),然后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,對(duì)母離子進(jìn)行破碎,得到碎片離子,選擇2個(gè)合適的離子作為子離子(定性離子),并對(duì)目標(biāo)化合物的定量、定性離子對(duì)進(jìn)行CE、DP、EP、CXP等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。最終得到40種抗生素在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的質(zhì)譜參數(shù)(見(jiàn)表1)。

圖 1 40種抗生素(100 μg/L)的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of the 40 antibiotics (100 μg/L) 1. SA; 2. SDZ; 3. LIN; 4. ST; 5. SNM; 6. SMZ; 7. MBX; 8. ENX; 9. OXY; 10. MET; 11. FLX; 12. SM2; 13. NOR; 14. OFX; 15. PFLX; 16. CIP; 17. TCY; 18. LOM; 19. SMT; 20. SPD; 21. SMD; 22. ERX; 23. SMM; 24. AZM; 25. SPI; 26. SD; 27. CHL; 28. CLI; 29. SMX; 30. DOX; 31. SOX; 32. SBD; 33. SDM; 34. TRI; 35. ERY; 36. TLS; 37. CLR; 38. ROX; 39. PEN G; 40. AMP.

2.2 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

在酸性條件下,大部分目標(biāo)抗生素在采用正離子(ESI+)模式掃描時(shí)響應(yīng)較高[28]。因此本方法選擇正離子模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析,并分別以甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液作為流動(dòng)相,考察40種抗生素(100 μg/L)的色譜分離效果。結(jié)果表明,以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)較好,但部分目標(biāo)化合物未出峰,而以乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí),部分目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)明顯增強(qiáng)。因此,選擇乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液作為流動(dòng)相。40種抗生素(100 μg/L)的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 洗脫條件的選擇

由于抗生素種類(lèi)較多，各類(lèi)抗生素之間理化差異較大，使用單一的有機(jī)溶劑洗脫得不到較好的洗脫效果。采用Oasis HLB固相萃取柱富集抗生素樣品時(shí)，常使用甲醇或2%(v/v)氨水甲醇溶液進(jìn)行洗脫，文獻(xiàn)[29-31]顯示，采用12 mL甲醇洗脫時(shí)，非磺胺類(lèi)抗生素的洗脫效果較好，而采用12 mL 2%(v/v)氨水甲醇溶液洗脫能提高磺胺類(lèi)抗生素的回收率。因此，采用6 mL甲醇和6 mL 2%(v/v)氨水甲醇溶液依次對(duì)固相萃取柱進(jìn)行洗脫，以保證各抗生素均可獲得較高的回收率。

2.4 方法學(xué)確證

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

采用外標(biāo)法定量,分別配制1、2、5、10、20、50、100和200 μg/L的40種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用HPLC-MS/MS檢測(cè)后,以響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(y),其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,在1～200 μg/L范圍內(nèi),目標(biāo)化合物的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。以信噪比(S/N)≥3和S/N≥10定義儀器的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果表明，40種抗生素的LOD和LOQ分別為0.001～1.252 μg/L和0.003～4.173 μg/L。對(duì)40種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)連續(xù)測(cè)定3次,連續(xù)測(cè)定3天,計(jì)算日內(nèi)和日間精密度,結(jié)果見(jiàn)附表1(詳見(jiàn)http://www.chrom-China.com,下同)。

2.4.2方法的回收率

根據(jù)已有文獻(xiàn)[28,32],大部分抗生素的暴露水平在ng/L～μg/L級(jí)別,以去離子水為基底進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)水平為20 ng/L和200 ng/L,按照1.3節(jié)所述方法對(duì)樣品進(jìn)行處理,設(shè)置3個(gè)平行樣,1個(gè)空白水樣,考察方法的回收率和精密度。結(jié)果表明,各目標(biāo)抗生素的加標(biāo)回收率為41.3%～112.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～14.0%(見(jiàn)附表1)。

2.4.3方法學(xué)比較

與其他已有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相比(見(jiàn)表2),回收率和檢出限可以滿(mǎn)足定量分析要求,此外,從總離子流色譜圖(見(jiàn)圖1)可以看出,40種抗生素在21 min內(nèi)均可出峰。因此,本方法具有靈敏、高效和可靠的優(yōu)點(diǎn)。

表 2 與其他文獻(xiàn)方法的比較

QUs: quinolones; TCs: tetracyclines; MAs: macrolides; FQs: fluoroquinolones; GLs: glycopeptide; CPs: cephalosporins; CHs: chloramphenicol; AMs: amphenicols; RIs: rifamycins; LAs: lactams.

2.5 實(shí)際水樣分析

使用建立的方法對(duì)長(zhǎng)江南京段16個(gè)表層水體中的抗生素進(jìn)行分析,共檢出4類(lèi)13種抗生素(見(jiàn)表3),含量為2.3～739.4 ng/L,其余抗生素含量均低于檢出限(nd)?；前奉?lèi)抗生素檢出磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺吡啶,含量低于中國(guó)漢江平原主要河流[44](nd～37.4 ng/L,均值13.4 ng/L)、黃河三角洲[45](2.2～764.9 ng/L,均值259.6 ng/L)和鄱陽(yáng)湖[46](nd～56.2 ng/L),磺胺吡啶僅在S11采樣點(diǎn)檢出(8.3 ng/L)。喹諾酮類(lèi)抗生素中恩諾沙星的檢出率為100%,含量范圍為0.3 ～ 8.6 ng/L,均值為1.1 ng/L,低于中國(guó)漢江平原主要河流[44](nd～53.1 ng/L,均值10.7 ng/L)的污染水平,其中S11處的含量為8.6 ng/L,可能存在點(diǎn)源污染;依諾沙星和氧氟沙星分別僅在S8(16.4 ng/L)和S3(2.3 ng/L)檢出,其余喹諾酮類(lèi)抗生素含量均低于檢出限水平。四環(huán)素類(lèi)抗生素僅檢出強(qiáng)力霉素,檢出率為62.5%,含量為nd～14.6 ng/L,均值為6.2 ng/L,低于中國(guó)香港的河流表層水[47](nd～82.2 ng/L,均值27.0 ng/L)以及國(guó)內(nèi)鄱陽(yáng)湖[46](nd～39.7 ng/L)的水平。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素中阿奇霉素、羅紅霉素、克林霉素、克拉霉素和林可霉素在水樣中均有檢出,檢出率順序?yàn)榭死顾?克林霉素、林可霉素>阿奇霉素>羅紅霉素,而螺旋霉素、泰樂(lè)菌素和紅霉素均未檢出,其中水樣S14中克林霉素和林可霉素的含量分別為739.4 ng/L和22.0 ng/L,整體上,大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素在長(zhǎng)江南京段表層水中的含量顯著低于江漢平原主要河流[29](95.1～2 910 ng/L)。

表 3 長(zhǎng)江南京段表層水中40種抗生素的暴露水平

Max: maximum contents; Ave: average contents; Med: medium contents; Fre: frequency; nd: less than LOD.

3 結(jié)論

建立了SPE-HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定水體中5類(lèi)40種抗生素的分析方法。該方法操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,穩(wěn)定性好。