楊 霄,黃華偉,伍遠(yuǎn)安,萬譯文,李小玲,黃向榮*

(1. 湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所, 湖南 長沙 410153; 2. 水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南 常德 415000; 3. 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(長沙), 湖南 長沙 410153)

貝類毒素(海洋生物毒素)特指主要由海洋有毒微藻或微生物產(chǎn)生,能夠在海洋生物尤其是雙殼貝類中富集的、對其他生物包括人類產(chǎn)生危害的一大類小分子有毒化合物[1]。貝類毒素是目前已知的最毒的一類有機(jī)化合物之一,人誤食了含有毒素的貝類后會有一定的健康風(fēng)險,由這些海洋生物毒素引起的疾病包括頭痛、嘔吐和腹瀉,嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡。貝類毒素根據(jù)其溶解性可分為水溶性貝類毒素和脂溶性貝類毒素。脂溶性貝類毒素是指一些含有聚醚類結(jié)構(gòu),具有熱穩(wěn)定性,易溶解于甲醇、乙醚等非極性有機(jī)溶劑的微藻毒素。目前常見的脂溶性貝類毒素主要有米氏裸甲藻貝毒素(gymnodimine, GYM)、螺環(huán)內(nèi)酯毒素(spirolides, SPX1)、蛤毒素(pectenotoxin, PTX2)、原多甲藻酸毒素(azaspiracids, AZA1、AZA2、AZA3)、大田軟海綿酸(okadaicacid, OA)及其衍生物鰭藻毒素(dinophysistoxins, DTX1、DTX2)、蝦夷扇貝毒素(yessotoxin, YTX)等。歐盟對貝肉中部分毒素的安全限量如下:OA、PTX和AZA均為160 μg/kg, YTX為1.0 mg/kg, GYM、SPX等環(huán)亞胺類毒素還未設(shè)定安全限量[2]。脂溶性貝類毒素具有脂溶性特征,容易在貝類體內(nèi)長期累積,且其毒性大,中毒后反應(yīng)快,無適宜的解毒劑,不僅嚴(yán)重威脅著消費者的身體健康和生命安全,同時也嚴(yán)重制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展,因而受到國際社會的重點關(guān)注[3]。

傳統(tǒng)的貝類毒素檢測方法為小老鼠生物分析法(MBA法),但因其不能判定多種毒素的具體組分,且靈敏度和準(zhǔn)確度均欠佳,已被歐盟于2012年采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法(EN 16204-2012)替代。LC-MS/MS法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點,雖然使用該方法檢測貝類毒素的研究在我國起步較晚,但發(fā)展最為迅速,目前采用LC-MS/MS法一次性分離多種貝類毒素已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點[3-10]。

貝類產(chǎn)品基質(zhì)較為復(fù)雜,樣品前處理過程中必須充分地減少基質(zhì)對目標(biāo)物測定的干擾,國內(nèi)已有的研究報道多采用功能性聚合物等吸附劑填充的固相萃取柱[3-7]或基質(zhì)分散固相萃取技術(shù)進(jìn)行樣品前處理過程中的富集和凈化[8-10]。固相萃取技術(shù)(solid-phase extraction, SPE)是一種常用于樣品前處理領(lǐng)域的經(jīng)典萃取技術(shù)[11,12]。但傳統(tǒng)的SPE仍存在一些不足之處,如萃取過程繁雜耗時,萃取裝置、耗材成本高,制備流程復(fù)雜,吸附劑填料選擇范圍小,因此,開發(fā)更優(yōu)異的樣品前處理技術(shù)或改進(jìn)傳統(tǒng)SPE技術(shù)對貝類樣品中貝類毒素的靈敏、快速、低成本檢測顯得尤為重要。

石墨烯(graphene)是2004年英國曼徹斯特大學(xué)物理和天文學(xué)系的Novoselov和Geim等[13]發(fā)現(xiàn)的一種新型二維平面碳納米材料。由于其具有大的比表面積、大的共軛體系、很強(qiáng)的疏水性和化學(xué)穩(wěn)定性等特點,石墨烯在電子、信息、能源、材料、催化、吸附和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值[14,15]。石墨烯作為一種新型的吸附材料,目前已經(jīng)在固相萃取、固相微萃取、磁性固相萃取、分散固相萃取、基質(zhì)固相分散萃取、微型化固相萃取等樣品前處理領(lǐng)域得到較為廣泛的關(guān)注和應(yīng)用[15-18]。

樣品前處理技術(shù)的趨勢之一是裝置的小型化[19]。管尖固相萃取是一種小型化的樣品前處理技術(shù),具有吸附劑和有機(jī)溶劑用量少、操作簡便快速等優(yōu)點。由于其具有大的比表面積、高的吸附容量等特點,石墨烯是一種理想的可用于制作小型化固相萃取裝置的吸附材料[20]。石墨烯-管尖固相萃取技術(shù)將石墨烯和管尖固相萃取各自的優(yōu)點相結(jié)合,在樣品前處理領(lǐng)域具有良好的研究價值和應(yīng)用前景。目前,該技術(shù)已成功應(yīng)用于環(huán)境水樣[20]、牛奶[21]、果汁[22]、貝類產(chǎn)品[23]、豆芽[24]、減肥補(bǔ)充劑[25]、人血漿[26]等復(fù)雜基質(zhì)樣品中目標(biāo)化合物的分析檢測。

本實驗制作了設(shè)計簡單、環(huán)保、低成本的石墨烯-管尖固相萃取(graphene-based pipette tip solid-phase extraction, G-PT-SPE)裝置,并將其應(yīng)用于貝類產(chǎn)品前處理的富集和凈化過程,結(jié)合LC-MS/MS技術(shù),建立了一種簡單、快速測定貝類產(chǎn)品中10種脂溶性貝類毒素的方法。實驗對提取劑、石墨烯的用量、淋洗劑的種類和用量、洗脫劑的種類和用量等實驗參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)的實驗條件下,將建立的新方法成功應(yīng)用于實際貝類樣品的分離檢測,取得了滿意的結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Access液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司);漩渦振蕩器(美國Fisher公司);氮吹儀(美國Organomation公司);中沃超純水儀(中沃水務(wù)環(huán)?？萍加邢薰?。

GYM(CRM-GYM-b,(2.50±0.13) μg/mL)、SPX1(CRM-SPX1,(7.0±0.4) μg/mL)、PTX2(CRM-PTX2-b,(4.40±0.13) μg/mL)、OA(CRM-OA-d,(8.4±0.4) μg/mL)、DTX1(CRM-DTX1-b,(8.52±0.66) μg/mL)、DTX2(CRM-DTX2-b,(3.8±0.2) μg/mL)、AZA1(CRM-AZA1-b,(1.30±0.07) μg/mL)、AZA2(CRM-AZA2-b,(1.22±0.06) μg/mL)、AZA3(CRM-AZA3,(1.04±0.04) μg/mL)、YTX(CRM-YTX-c,(4.92±0.23) μg/mL) 標(biāo)準(zhǔn)溶液均購自加拿大海洋生物科學(xué)研究所(NRC);甲醇、乙腈、正己烷(色譜純,德國Merck公司);甲酸(LC-MS級,美國Sigma公司);實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm);石墨烯(厚度:約1 nm,片徑:1～100 μm)購自南京吉倉納米科技有限公司。

貝類樣品主要包括僧帽牡蠣(Saccostreacucullata)、紫貽貝(Mytilusedulis)和毛蚶(Scapharcasubcrenata),于2017年6月到9月采自福建省福州、漳州、廈門的貝類養(yǎng)殖戶和水產(chǎn)品市場。貝類樣品運(yùn)至實驗室后用水洗凈,開殼取其貝肉,瀝干水分,勻漿,于-18 ℃冷凍保存。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取適量的10種貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇稀釋配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中OA、DTX1、DTX2、YTX的質(zhì)量濃度為0.5 mg/L, PTX2的質(zhì)量濃度為0.25 mg/L, GYM、SPX1、AZA1、AZA2、AZA3的質(zhì)量濃度為0.125 mg/L。

1.3 樣品處理

1.3.1提取

稱取2.0 g (±0.02 g)樣品于50 mL離心管中,加入5 mL甲醇,渦旋混勻1 min,超聲提取5 min, 8 000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一個50 mL離心管中。向下層殘渣中加入5 mL甲醇重復(fù)提取一次,合并上清液。在提取液中加入甲醇飽和的正己烷5 mL,渦旋混勻1 min,靜置分層棄去正己烷層。于40～50 ℃下氮吹至約0.5 mL,加入2.5 mL水渦旋混勻,超聲1 min, 12 000 r/min離心5 min,待凈化。

1.3.2G-PT-SPE裝置組裝及SPE凈化過程

取200 μL、1 mL移液槍頭各一個,用甲醇和水洗滌干凈后于室溫下晾干。根據(jù)200 μL移液槍頭的形狀特點在槍頭末端一固定的位置填充適量的脫脂棉,稱取2.0 mg石墨烯粉末填裝到200 μL槍頭中,再往槍頭石墨烯層上端填充適量的脫脂棉。然后根據(jù)1 mL移液槍頭的形狀特點在槍頭下端一固定位置切去一段并將其插入到上述200 μL槍頭上端即組裝成G-PT-SPE裝置。依次用1 mL甲醇和1 mL水預(yù)處理小柱,然后加入提取液,再用1 mL 10%(v/v)的甲醇水溶液淋洗,最后用1 mL 1%(v/v)氨水甲醇溶液洗脫,收集洗脫液,用甲醇定容至1 mL,過0.22 μm濾膜,濾液供LC-MS/MS測定。

1.4 空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取空白基質(zhì)樣品,按1.3節(jié)的樣品前處理方法制備空白基質(zhì)溶液,添加適量1.2節(jié)中配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成OA、DTX1、DTX2、YTX的質(zhì)量濃度為2、10、20、100、200 μg/L, PTX2的質(zhì)量濃度為1、5、10、50、100 μg/L, GYM、SPX1、AZA1、AZA2、AZA3的質(zhì)量濃度為0.5、2.5、5、25、50 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液,并分別上機(jī)進(jìn)行測定。以被測組分的峰面積y為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度x(μg/L)為橫坐標(biāo),繪制空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1色譜條件

Kinetex XB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱溫30 ℃;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;流動相A為水溶液,B為乙腈-水溶液(95∶5, v/v),兩者均含有0.19%(v/v)甲酸和2 mmol/L甲酸銨;梯度洗脫程序:0～7.0 min, 20%B～90%B; 7.0～10.0 min, 90%B; 10.0～12.0 min, 20%B。

1.5.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM);噴霧電壓:正離子3 500 V,負(fù)離子-3 000 V;離子傳輸毛細(xì)管溫度為350 ℃;蒸發(fā)溫度為320 ℃;鞘氣壓力為40 arb,輔助氣壓力為10 arb,碰撞氣壓力199.983 mPa (1.5 mtorr)。優(yōu)化后的其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS條件的確定

2.1.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵直接進(jìn)樣的方式,以10 μL/min的流速,將1.2節(jié)配制的GYM、SPX1、PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、OA、DTX1、DTX2、YTX混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中。分別在正負(fù)離子模式下對化合物進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描,發(fā)現(xiàn)GYM、SPX1、PTX2、AZA1、AZA2、AZA3在正離子模式下質(zhì)譜信號強(qiáng),OA、DTX1、DTX2、YTX在負(fù)離子模式下質(zhì)譜信號強(qiáng)。利用一級質(zhì)譜掃描分析目標(biāo)化合物的分子離子峰,選取各化合物靈敏度高、穩(wěn)定性好的離子為母離子,優(yōu)化噴霧電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力、離子傳輸毛細(xì)管溫度等參數(shù)。然后利用二級質(zhì)譜全掃描收集各組分母離子對應(yīng)的子離子信息,分別從中選取相對豐度最強(qiáng)和次強(qiáng)的子離子作為各自的定量離子和定性離子,并優(yōu)化碰撞能。最終確定1.5.2節(jié)所述的質(zhì)譜條件。

表 1 10種貝類毒素的質(zhì)譜分析參數(shù)

* Quantitative ion.

2.1.2色譜條件的確定

色譜條件參考文獻(xiàn)[3,4]確定。在1.5.1節(jié)條件下,10種毒素可在12 min內(nèi)出峰,分析時間短,且峰形尖銳,具有較高的靈敏度和分離度(見圖1)。

圖 1 10種貝類毒素的SRM色譜圖Fig. 1 SRM chromatograms of the ten shellfish toxins SRM: selected reaction monitoring. LC conditions: Kinetex XB-C18 column (100 mm×2.1 mm, 2.6 μm); mobile phases: water (A) and acetonitrile (B) both containing 2 mmol/L ammonium formate and 0.19% (v/v) formic acid. Gradient program: 0-7.0 min, 20%B-90%B; 7.0-10.0 min, 90%B; 10.0-12.0 min, 20%B. Flow rate: 0.3 mL/min. Column temperature: 30 ℃. Injection volume: 10 μL.

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1提取劑的選擇

分別考察了甲醇、80%(v/v)甲醇水溶液提取貝類樣品中貝類毒素的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在空白牡蠣中添加同一水平的毒素后,80%甲醇水溶液對GYM、SPX1、PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、OA、DTX1、DTX2提取的回收率較高,均大于70%,對YTX提取回收率很低,低于60%,不能滿足10種毒素同時分析測定的要求,而甲醇對10種毒素提取的回收率均大于75%,同時考慮到甲醇的揮發(fā)速率大于80%(v/v)甲醇水溶液,氮吹時較易濃縮,故本實驗選用甲醇為提取劑。

2.2.2G-PT-SPE條件的優(yōu)化

貝類樣品基質(zhì)復(fù)雜,貝肉中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等物質(zhì),故需要對甲醇粗提液進(jìn)行凈化處理。石墨烯具有大的比表面積、獨特的化學(xué)特性以及大的吸附容量,可以對貝類樣品中的目標(biāo)組分進(jìn)行較好的富集和凈化。本研究采用正己烷對甲醇提取液進(jìn)行初步去脂和實驗室自制的G-PT-SPE裝置對提取液進(jìn)行固相萃取,為了獲得較高的萃取回收率,實驗對石墨烯的用量、淋洗劑的種類和用量、洗脫劑的種類和用量進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.2.1石墨烯的用量

實驗考察了不同用量的石墨烯對10種毒素的萃取效率的影響。結(jié)果如圖2所示,當(dāng)石墨烯的用量從0.5 mg增加到2.0 mg時,各組分回收率都有明顯增大;繼續(xù)增加石墨烯的用量,各組分回收率無明顯變化,甚至稍有下降。因此,選擇2.0 mg石墨烯作為最佳的吸附劑用量。

圖 2 石墨烯用量對10種貝類毒素回收率的影響(n=3)Fig. 2 Effect of the amount of graphene on the recoveries of the ten shellfish toxins (n=3)

圖 3 淋洗劑對10種貝類毒素回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of washing solvents on the recoveries of the ten shellfish toxins (n=3)

2.2.2.2淋洗劑的種類和用量

固相萃取的淋洗步驟可以有效地去除樣品粗提液中共吸附的干擾雜質(zhì)。合適的淋洗劑必須在凈化樣品提取液的同時盡可能地減少目標(biāo)組分的損失以獲得較高的回收率。本實驗考察了不同種類淋洗劑對目標(biāo)物回收率的影響。實驗中我們選取甲醇、甲醇-水(1∶1, v/v)溶液、甲醇-水(1∶4, v/v)溶液、甲醇-水(1∶9, v/v)溶液以及水作為淋洗劑,考察其對目標(biāo)組分的提取回收率的影響,實驗結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出,甲醇和甲醇-水(1∶1, v/v)溶液作為淋洗劑會造成所有目標(biāo)組分很大程度的損失,甲醇-水(1∶4, v/v)溶液作為淋洗劑時各目標(biāo)組分都有一定程度的損失,而甲醇-水(1∶9, v/v)溶液和水作為淋洗劑所有目標(biāo)物均可獲得較高的回收率?？紤]到甲醇-水(1∶9, v/v)溶液作為淋洗劑比水的凈化效果更好,最終選擇甲醇-水(1∶9, v/v)溶液作為淋洗劑。同時還考察了甲醇-水(1∶9, v/v)溶液的用量(0.5～2.0 mL)對目標(biāo)物回收率的影響,結(jié)果顯示,當(dāng)淋洗劑的體積從0.5 mL增加到1.0 mL時,目標(biāo)物的回收率保持穩(wěn)定;當(dāng)淋洗劑的體積從1.0 mL增加到2.0 mL時,目標(biāo)物的回收率有不同程度的降低。因此,最終選擇1.0 mL的甲醇-水(1∶9, v/v)溶液作為淋洗劑。

2.2.2.3洗脫劑的種類和用量

選擇合適的洗脫劑將目標(biāo)物從吸附劑上洗脫下來是整個萃取過程的關(guān)鍵。貝類毒素在石墨烯吸附劑上的保留能力與毒素的親脂特性、極性以及所帶電荷狀態(tài)有關(guān),因此洗脫劑的酸堿性對毒素在固相萃取柱上的洗脫效果至關(guān)重要[23]。貝類毒素固相萃取常用的洗脫劑為不同pH條件的甲醇溶液,本實驗重點考察了1%(v/v)的甲酸甲醇溶液、甲醇以及1%(v/v)的氨水甲醇溶液作為洗脫劑時對毒素回收率的影響,結(jié)果見圖4。從圖4中可以看出,GYM、SPX1、PTX2、AZA1、AZA2、AZA3在堿性條件的洗脫效果(回收率為85%～90%)明顯優(yōu)于酸性和中性條件(回收率為75%～83%), OA、DTX1、DTX2在酸性、中性和堿性條件下均具有較好的洗脫效果,回收率為79%～85%, YTX在酸性條件下回收率不足60%,洗脫效果很差,而在堿性條件下回收率接近80%。因此,基于堿性條件下10種貝類毒素均具有較好的洗脫效果,本實驗選擇1%(v/v)的氨水甲醇溶液作為洗脫劑。為確保分析物被洗脫完全且不浪費洗脫劑,實驗對洗脫劑的體積進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)1.0 mL的洗脫劑即可將10種毒素洗脫完全。因此,選擇1.0 mL 1%(v/v)的氨水甲醇溶液作為洗脫劑。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1線性范圍和靈敏度

為了降低基質(zhì)效應(yīng)對貝類毒素定量造成的誤差,本實驗按照1.4節(jié)的方法制作基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用在空白樣品中添加低濃度目標(biāo)組分的方法,以信噪比(S/N)=3和S/N=10分別確定各毒素的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。10種貝類毒素的線性范圍、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。由表2可知,10種貝類毒素的線性關(guān)系良好,靈敏度較高,說明本方法適用于10種貝類毒素的定量分析。

圖 4 洗脫劑對10種貝類毒素回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of elution solvents on the recoveries ofthe ten shellfish toxins (n=3)

2.3.2準(zhǔn)確度和精密度

選取陰性牡蠣作為空白基質(zhì)樣品,分別添加3個濃度水平的貝類毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個濃度水平做6個平行樣,按本方法進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度實驗,結(jié)果如表3所示,10種貝類毒素的回收率為72.0%～101.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.63%～14.1%,表明該方法的準(zhǔn)確度高,重復(fù)性好,滿足毒素的日常檢測要求。

表 2 10種貝類毒素的線性范圍、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表 3 (續(xù))

2.4 貝類樣品的污染狀況調(diào)查

采用所建立的方法對78個貝類樣品進(jìn)行分析檢測,發(fā)現(xiàn)2個陽性樣品,其中一份僧帽牡蠣檢出GYM,含量為2.36 μg/kg;一份紫貽貝同時檢出SPX和YTX,含量分別為5.10 μg/kg和16.3 μg/kg,均低于歐盟限量要求。

3 結(jié)論

本文以商品化的石墨烯材料作為固相萃取吸附劑,設(shè)計制作了經(jīng)濟(jì)、高效的石墨烯-管尖固相萃取裝置,并進(jìn)一步研究了其對貝類樣品中10種脂溶性貝類毒素的萃取吸附性能。在優(yōu)化了石墨烯用量、淋洗劑種類和用量、洗脫劑種類和用量等一系列影響固相萃取的因素后,建立起一種石墨烯-管尖固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定貝類樣品中10種脂溶性貝類毒素的方法。將該方法應(yīng)用于實際貝類樣品的檢測,實驗結(jié)果令人滿意。本文建立的方法操作簡便、靈敏度高,拓展了石墨烯在復(fù)雜生物樣品前處理領(lǐng)域的應(yīng)用。