1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712000;2.陜西省交通醫(yī)院，陜西 西安 710000

肝纖維化是指肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(特別是膠原物質(zhì))的過(guò)度沉積[1]，是各種病因引起的肝臟損傷后的一種損傷修復(fù)反應(yīng)，其中肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)的活化是關(guān)鍵，因?yàn)楦闻K受損后HSC活化是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源。氧化應(yīng)激是造成HSC活化增殖的重要因素，研究表明氧化應(yīng)激相關(guān)分子過(guò)氧化氫(H2O2)能夠刺激HSC活化增殖，改變細(xì)胞外基質(zhì)的沉降[2-3]。

隨著肝組織的持續(xù)損傷，增生的纖維組織逐步取代正常的肝組織，最終發(fā)展成為肝硬化，其在全球呈現(xiàn)出高發(fā)病率以及高死亡率[4]。肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展成為肝硬化的一個(gè)中間環(huán)節(jié)。肝纖維化屬于可逆性病變[5]，若在臨床早期采取抗肝纖維化治療，將對(duì)慢性肝病的治療以及阻止肝硬化的發(fā)生會(huì)產(chǎn)生非常積極的作用。目前，在抗肝纖維化方面中醫(yī)藥表現(xiàn)出獨(dú)特的療效，而且多是采用舒肝理氣、活血類中藥，其對(duì)于多種慢性肝病的治療具有積極意義[6]。課題組前期研究表明，柴胡-黃芩配伍水煎液對(duì)大鼠肝纖維化模型具有良好的保護(hù)作用[7]，但對(duì)于柴胡-黃芩藥對(duì)抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未見(jiàn)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)在建立體外H2O2刺激HSC活化增殖的基礎(chǔ)上，觀察柴胡-黃芩藥對(duì)不同分離部位的抗肝纖維化作用，以期尋找柴胡-黃芩藥對(duì)抗肝纖維化主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究抗肝纖維化藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試藥 中藥材柴胡和黃芩均購(gòu)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院中藥房，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室教師鑒定為正品，符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞 大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，購(gòu)自灝洋生物公司。

1.3 試劑與材料 胎牛血清(批號(hào)：FB-10，美國(guó)KIRGEN公司)；DMEM-H(美國(guó)Hyclone公司)；胰蛋白酶(批號(hào)：1939066)、青鏈霉素雙抗(批號(hào)：1924794)美國(guó)Gibco公司；透明質(zhì)酸酶試劑盒(hy-aluronidase，HA，批號(hào):201805)、層黏連蛋白試劑盒(laminin，LN，批號(hào):201805)、Ⅲ型前膠原試劑盒(procollagen Ⅲ，PCⅢ，批號(hào):201805)、Ⅳ型膠原試劑盒(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C，批號(hào):201805)購(gòu)自上海優(yōu)選生物科技有限公司；MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-四氮唑溴鹽)(批號(hào)：EZ2811B347，美國(guó)Sigma公司)；乙醇為分析純(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；D101大孔吸附樹(shù)脂(天津市海光化工有限公司)；30%H2O2(天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱(新加坡ESCO)；倒置顯微鏡(奧特 BDS200)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek ELx808)；離心機(jī)(湘儀 L530)；雙人型超凈工作臺(tái)(新加坡 ESCO)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A(上海亞榮生化儀器廠)。

1.5 方法

1.5.1 柴胡-黃芩水提液的制備 參照文獻(xiàn)及課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8]，柴胡飲片50 g、黃芩飲片25 g，共75 g，加入8倍量水浸泡30 min，煎煮，并保持沸騰30 min；過(guò)濾，再加入8倍量水煎煮30 min。過(guò)濾，合并兩次濾液混勻濃縮至150 mL，即得濃度為0.5 g/mL的柴胡-黃芩水提液。將得到的柴胡-黃芩水提液平均分成兩份，一份用于分離制備不同部位，一份進(jìn)行干燥得干粉用于后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 柴胡-黃芩不同分離部位的制備 參照文獻(xiàn)方法制備柴胡-黃芩不同分離部位[9-11]，將上述0.5 g/mL的柴胡-黃芩水提液上D101大孔吸附樹(shù)脂柱，徑高比為1∶10以上，依次用水和30%，60%，90%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，得到水和30%，60%，90%乙醇洗脫4個(gè)不同極性部位，即水洗脫部位(A)、30%乙醇洗脫部位(B)、60%乙醇洗脫部位(C)、90%乙醇洗脫部位(D)，分別干燥得干燥粉末。

1.5.3 大鼠HSC的培養(yǎng) 將大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HSC，以5×104(個(gè))/mL濃度接種到96孔培養(yǎng)板中過(guò)夜。

1.5.4 H2O2刺激HSC增殖模型的建立 參照文獻(xiàn)方法建立H2O2刺激的HSC增殖模型[2-3]。將30%H2O2用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，分別配制成為終濃度為0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L的H2O2溶液。加入到細(xì)胞貼壁后的96孔板中，每個(gè)濃度分別設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率%=(試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.5.5 藥物處理 實(shí)驗(yàn)分組如下:對(duì)照組(無(wú)藥物處理)，H2O2模型組(5 μmol/L H2O2作用24 h)，給藥組(5 μmol/L H2O2作用24 h后，再用柴胡-黃芩及A、B、C、D高中低劑量作用24 h)。

1.5.6 柴胡-黃芩及其不同分離部位對(duì)H2O2刺激的HSC增殖的影響 各組培養(yǎng)24 h后，加入5 mg/mL MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，低速震蕩10 min，以充分溶解被還原的MTT結(jié)晶，酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。

1.5.7 柴胡-黃芩及其不同分離部位對(duì)H2O2刺激的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響 各組培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞上清液，參照試劑盒使用說(shuō)明書，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量。

2 結(jié)果

2.1 H2O2刺激HSC增殖模型的建立 在H2O2濃度0～5 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，H2O2對(duì)HSC具有活化促增殖作用，且具有一定的劑量相關(guān)性；在H2O2濃度為5 μmol/L時(shí)對(duì)HSC具有明顯的活化促增殖作用(P<0.01)；在H2O2濃度大于5 μmol/L時(shí)，隨著濃度的不斷增大，H2O2對(duì)HSC的激活作用逐漸減弱，且在H2O2濃度為20μmol/L時(shí)HSC的存活率僅50%左右，H2O2對(duì)HSC表現(xiàn)為顯著的抑制作用(P<0.01)。綜上所述，本課題組選用5μmol/L H2O2作用24 h作為HSC的增殖模型。如圖1所示。

2.2 柴胡-黃芩及其不同分離部位對(duì)H2O2刺激的HSC增殖的影響 與對(duì)照組比較，H2O2干預(yù)后，能夠顯著促進(jìn) HSC的增殖(P<0.01)；與H2O2組相比，柴胡-黃芩組(高、中劑量組)、A組(高劑量組)、B組(高、中劑量組)、C組(高、中劑量組)及D組(高劑量組)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HSC增殖均具有一定的抑制作用，其中柴胡-黃芩高劑量組及B組高劑量組、C組高劑量組對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HSC增殖具有尤其明顯的抑制作用(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 柴胡-黃芩及其不同分離部位對(duì)H2O2刺激的HSC增殖的影響

注：與H2O2組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 柴胡-黃芩及其不同分離部位對(duì)H2O2刺激的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響 與對(duì)照組比較，H2O2作用于HSC后，HSC分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量明顯升高；與H2O2組比較，柴胡-黃芩組及A組、B組、C組、D組可以明顯降低H2O2誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量，其中柴胡-黃芩組高劑量組、A組高劑量組及B組高劑量組對(duì)其作用最為明顯(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 柴胡-黃芩及其不同分離部位對(duì)H2O2刺激的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響

注：與H2O2組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

HSC的激活過(guò)程是肝臟膠原產(chǎn)生和肝纖維化形成的重要環(huán)節(jié)。在一系列刺激因素的作用下，HSC被活化轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，細(xì)胞大量增殖，合成細(xì)胞外基質(zhì)，在肝臟內(nèi)大量沉積，造成肝纖維化。氧化應(yīng)激在HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)生成中具有重要作用，H2O2是氧化應(yīng)激的相關(guān)分子，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)H2O2能夠刺激HSC活化和細(xì)胞外基質(zhì)的生成[2-3]。

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)階段?，F(xiàn)研究認(rèn)為肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，屬于可逆性病變[5]，而肝硬化則是一種不可逆性病變。因此，抗肝纖維化則成為治療慢性肝病以及預(yù)防肝硬化的重要目標(biāo)。源自漢代張仲景的小柴胡湯是臨床治療肝病的常用方劑，具有確切的抗肝纖維化療效[12-14]，柴胡-黃芩是小柴胡湯的核心藥對(duì)。本課題組前期以小柴胡湯中的核心藥對(duì)柴胡-黃芩的抗肝纖維化作用為切入點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)其水提液具有確切抗肝纖維化作用[7]。為了進(jìn)一步探究柴胡-黃芩藥對(duì)抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，篩選出其發(fā)揮抗肝纖維化作用的有效部位，故本實(shí)驗(yàn)在建立體外H2O2刺激HSC活化增殖的基礎(chǔ)上，觀察柴胡-黃芩藥對(duì)不同分離部位的抗肝纖維化作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HSC經(jīng)H2O2刺激后，大量增殖，其細(xì)胞培養(yǎng)液中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量顯著增加。由此可見(jiàn)，H2O2對(duì)于HSC具有一定的激活促增殖作用，使肝纖維化相關(guān)因子HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C分泌顯著增加，顯現(xiàn)出肝纖維化傾向。給予柴胡-黃芩藥對(duì)及其不同分離部位的高、中、低劑量干預(yù)后，各給藥組中的HSC的增殖均受到抑制，HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量也有所降低，其中柴胡-黃芩及B、C高劑量組中的HSC受到的抑制作用最為明顯，具有一定的劑量相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

綜上所述，柴胡-黃芩藥對(duì)及其B、C部位對(duì)H2O2刺激的肝星狀細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，B、C可能是柴胡-黃芩抗肝纖維化的主要有效部位。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道柴胡中主要含多糖、皂苷、揮發(fā)油、黃酮、甾醇類等成分[15]，黃芩中主要含黃酮、萜類、苷類、揮發(fā)油等成分[16]。根據(jù)各成分的性質(zhì)推測(cè)B、C中可能含有的成分為皂苷、黃酮苷類等成分，但其具體成分有待進(jìn)一步研究。單味中藥本身所含成分復(fù)雜多樣，藥對(duì)及復(fù)方甚之，且中醫(yī)復(fù)方講求整體性以及多種成分之間的相互關(guān)系，兩味中藥共同煎煮會(huì)出現(xiàn)怎樣的成分變化，以及不同分離部位進(jìn)行重新配伍組合以后會(huì)出現(xiàn)怎樣的現(xiàn)象，有待進(jìn)一步的研究，以期為抗肝纖維化中藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。