黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,貴州 都勻 558013

四氯化碳在生產(chǎn)和使用環(huán)節(jié)中易引起環(huán)境污染，中毒時(shí)有發(fā)生，腎中毒時(shí)主要表現(xiàn)為急性壞死性腎病。貴州苗藥阿銳布為玄參科腹水草屬寬葉腹水草Veronicastrumlatifolium(Hemsl.)Yamazaki的全草，具有清熱解毒、行水散瘀、活血化瘀的功效[1]，治療急慢性腎炎療效顯著[2]，在苗族民間主要用于治療肝炎、水腫、肝硬化腹水、急性腎炎、跌打損傷等[3]，但未見其對腎損傷的保護(hù)作用研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射四氯化碳構(gòu)建小鼠腎損傷模型，初步探討苗族藥阿銳布對小鼠腎臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料 50只昆明種小鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(渝)2017-0002，雌雄各半，體重(20.2±2.1)g。樣本藥材購置貴州省益康中藥堂，經(jīng)本校中藥教研室李香副教授鑒定為玄參科腹水草屬Veronicastrum.latifolium(Hemsl.)yamazaki。稱取500 g阿銳布的干燥全草粉碎，加蒸餾水2500 mL煎煮3 h，濾過；再加蒸餾水2000 mL煎煮2 h，濾過，合并兩次濾液，濃縮至一定程度后，加蒸餾水定容至1000 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.2 g·mL-1(按原藥材量計(jì))的阿銳布水提液，冷藏備用。CCl4購自北京化工廠，批號20131029；ALT、AST、MDA、SOD等試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20180520、20180522、20180517、20180518；聯(lián)苯雙酯購自廣州白云山星群藥業(yè)股份有限公司，批號H44023176。

1.2 分組與給藥 將50只小鼠按每組10只隨機(jī)平均分為正常組、模型組、及阿銳布低、中、高劑量組。各組每天灌胃給藥1次，連續(xù)14 d。阿銳布低、中、高劑量組分別灌胃100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、400 mg·kg-1，正常組和模型組以0.9%生理鹽水灌胃。除正常組外，余各組小鼠末次給藥后2 h，以0.02 mL·g-1腹腔注射0.4% CCl4花生油溶液，16 h后稱體重，摘眼球取血；后處死小鼠，取出腎臟，肉眼觀察顏色及形態(tài)變化。

1.3 儀器 SM-3型酶標(biāo)儀(北京天石科技有限責(zé)任公司)，7070型全自動生化分析儀(日本日立公司)；FA2004型電子天平(上海津平科學(xué)儀器有限公司)；7230G型可見分光光度計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)；LDZ-52型離心機(jī)(北京離心機(jī)廠)；生物組織切片機(jī)(LEICA RM2235,LEICA公司,德國)；光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX50,OLYM-PUS 公司,日本)。

1.4 觀察指標(biāo)及測定

1.4.1 腎系數(shù)的測定 處死小鼠后，取兩側(cè)全腎，濾紙吸干腎表面血液后稱重。計(jì)算腎系數(shù)。

腎系數(shù)=兩側(cè)腎質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(kg)×100%。

1.4.2 脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的測定 取部分腎皮質(zhì)，每樣本加1 mL預(yù)冷的生理鹽水，冰水浴中勻漿，于4 ℃，3000/min 離心15 min，取上清檢測。按照試劑盒提供的方法測定MDA含量及SOD活性。

1.5 病理切片分析 取一小塊(10 mm×5 mm)腎臟組織，經(jīng)固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE法染色，鏡下觀察各組腎臟組織病理變化。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 正常組大鼠皮毛光滑密澤，大便正常，進(jìn)食無異常；模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、食量減少、血尿等；而阿銳布各組組小鼠的精神狀況明顯好轉(zhuǎn)，血尿情況很大程度得以減輕。

2.2 各組小鼠腎系數(shù)測定結(jié)果 與模型組比較，空白組及高劑量組腎臟指數(shù)明顯升高(P﹤0.05或P﹤0.01)。見表1。

表1 阿銳布對CCl4致腎損傷小鼠腎臟指數(shù)的影響

注：與模型組相比aP﹤0.05，bP﹤0.01。

2.3 各組小鼠脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的測定 與模型組比較，阿銳布中、高劑量組MDA含量明顯降低(P﹤0.01)；阿銳布中、劑量高組SOD含量升高明顯(P<0.05或 <0.01)，表明中、高劑量的阿銳布具有較強(qiáng)的抗氧化作用。見表2。

表2 各組小鼠腎組織MDA、SOD的結(jié)果

注：與模型組相比,aP﹤0.01；bP﹤0.05;cP﹤0.01。

2.4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 正常組腎小球及腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)無異常(A)；模型組(B)腎組織間質(zhì)血管擴(kuò)張，充血，水腫，部分近端小管管壁上皮細(xì)胞濁腫明顯伴空泡變性，管腔狹小，部分近端小管管壁上皮細(xì)胞萎縮，管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)見紅細(xì)胞管型尿，腎小球出血、少數(shù)壞死；阿銳布低劑量組(C)與模型組比較，病變稍有減輕,但無明顯變化；阿銳布中劑量組(D)腎小球結(jié)構(gòu)清晰，大小、數(shù)量正常，間質(zhì)輕度水腫及少量小管管壁上皮細(xì)胞空泡變性；阿銳布高劑量組(E)腎小球及腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)接近正常。如圖1所示。

3 討論

已有研究表明, CCl4在體內(nèi)代謝后能夠形成自由基, 引起脂質(zhì)過氧化并導(dǎo)致組織器官結(jié)構(gòu)和功能的破壞[4]。貴州苗藥阿銳布為玄參科腹水草屬寬葉腹水草的全草，具有清熱解毒，行水散瘀，活血化瘀的功效[1]，治療急慢性腎炎療效顯著[2]；但未見其對腎損傷的保護(hù)作用研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)參照 KOICHIRO SUZUKI 等的實(shí)驗(yàn)方法建立 CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模[5]，初步探討苗族藥阿銳布對實(shí)驗(yàn)小鼠腎臟的保護(hù)作用。

腎的近端小管上皮細(xì)胞含有高濃度的微粒體酶，具有氧化外來化合物的作用[6]，而且機(jī)體大部分有機(jī)物質(zhì)的清除在近端小管完成，因此該部位細(xì)胞易受外界因素的影響；CCl4作用于肝臟中產(chǎn)生的自由基，通過血液進(jìn)入腎臟，并攻擊腎小管、腎小球細(xì)胞膜上的磷脂分子，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)生急性腎損傷[7]，并產(chǎn)生大量的MDA，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，致細(xì)胞腫脹、壞死[8]；實(shí)驗(yàn)中，模型組腎組織間質(zhì)血管擴(kuò)張，充血，水腫，部分近端小管管壁上皮細(xì)胞濁腫明顯伴空泡變性，管腔狹小，部分近端小管管壁上皮細(xì)胞萎縮，管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)見紅細(xì)胞管型尿，腎小球出血、少數(shù)壞死，以上觀察到的病理改變與CCl4致腎臟結(jié)構(gòu)破壞表現(xiàn)相一致，且模型組較空白組腎臟指數(shù)明顯降低(P<0.01)，提示注射四氯化碳構(gòu)建小鼠腎損傷模型造模成功；SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能起到清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用，還能夠反應(yīng)機(jī)體的抗氧化能力[9]；周伯旭等[10]從腹水草中分離出3-4二甲異阿魏酸。阿魏酸具有清除氧自由基、過氧化亞基、亞硝酸鹽、增加免疫功能、抗血小板凝集、抗菌消炎、抗腫瘤、抗突變等廣泛的藥理作用[11]。本研究中，模型組與正常組比較，MDA含量明顯升高(P﹤0.01)，SOD含量明顯降低(P﹤0.01)，提示模型組細(xì)胞內(nèi)活性氧成分積累過度，細(xì)胞嚴(yán)重受損。給予不同劑量阿銳布后，MDA表達(dá)水平下降，SOD含量明顯升高(P﹤0.01)，同時(shí)鏡下腎組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)逐步好轉(zhuǎn)，提示不同劑量阿銳布可能通過清除實(shí)驗(yàn)小鼠氧自由基和過氧化亞基，通過抗氧化作用保護(hù)腎損傷。尤其阿銳布高劑量組腎臟指數(shù)(P<0.05)明顯升高及高劑量組光鏡下形態(tài)學(xué)改變較模型組明顯得到改善，表明高劑量的阿銳布對四氯化碳致小鼠腎損傷有較好的保護(hù)作用。

綜上所述，苗藥阿銳布對腎損傷具有治療性作用，可能與其所含阿魏酸的異構(gòu)體3-4二甲異阿魏酸能清除氧自由基和過氧化亞基而產(chǎn)生的抗氧化作用機(jī)制有關(guān)。但關(guān)于阿銳布減輕腎損傷的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。