1.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011；2云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650000；3昆明市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，云南 昆明 650000

四逆湯是仲景名方，被譽(yù)為“回陽救逆第一方”。全方由附子、干姜、炙甘草三味藥組成，是治療少陰病陽虛陰盛證的主方，以陰盛陽衰，致四肢厥逆而命名;嘔吐、下利清谷、四肢厥逆、表熱里寒、下寒上熱、真寒假熱、脈沉微、沉遲、微細(xì)、脈微欲絕等，是本方的適應(yīng)證?，F(xiàn)代中醫(yī)運(yùn)用四逆湯治療臨床各科危重癥，凡具有心腎陽虛病理特點(diǎn)者，均可用該方治療，并取得了較好的臨床效果[1-2]，筆者在長期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，在四逆湯的臨證運(yùn)用中，對(duì)該經(jīng)方中君藥附子的用法和用量各家存在較大差異，《傷寒論》中四逆湯原方使用生附子入藥，原著中四逆湯附子的用法為“一枚生用去皮破八片”，此“一枚”者，一般為10～15 g，在2010版《中國藥典》中規(guī)定的四逆湯使用附片入藥，劑量為“3～15 g”，以吳榮祖教授為代表的云南吳氏扶陽學(xué)術(shù)流派，經(jīng)過長年的實(shí)踐，積累了大量成熟運(yùn)用四逆湯的臨床經(jīng)驗(yàn)，吳氏在組方上重用附子，采用附片入藥，劑量可用到100 g。由于不同醫(yī)家使用四逆湯時(shí)附子的用法和用量差異較大，在藥效學(xué)及毒性上是否也存在差異，目前尚不清楚，因此，本研究根據(jù)四逆湯主治諸證之癥狀與現(xiàn)代臨床膿毒癥休克的癥狀較為相似的特點(diǎn)，且有多項(xiàng)臨床及藥理研究亦表明四逆湯具有抗多種休克的臨床療效[3-4]，本實(shí)驗(yàn)選擇了小鼠膿毒癥模型為研究對(duì)象，對(duì)《傷寒論》組成四逆湯(下稱：傷寒四逆湯)、《中國藥典》組成四逆湯(下稱：藥典四逆湯)以及吳榮祖教授經(jīng)驗(yàn)組成四逆湯(下稱：吳氏四逆湯)抗膿毒癥的藥效學(xué)進(jìn)行了比較研究，并對(duì)3種四逆湯小鼠經(jīng)口給藥的急性毒性差異進(jìn)行了比較，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物 藥典四逆湯(組成：附片15 g，干姜10 g，炙甘草15 g)，傷寒四逆湯(組成：生附子15 g,干姜23.4 g,炙甘草31.2 g)，吳氏四逆湯(組成：附片100 g，干姜20 g，炙甘草10 g)。

1.2 動(dòng)物 昆明種健康小鼠160只，雌雄各半，體重量(20±2) g，SPF級(jí)，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。

1.3 試劑 附片、干姜、炙甘草飲片均購自慈慧藥業(yè)有限公司，生附子購自中國中藥公司四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，經(jīng)昆明市中醫(yī)醫(yī)院馬雁滔中藥師鑒定為正品；小鼠TNF-α(批號(hào)：20170801)、IL-1β(批號(hào)：20170805)、IL-6(批號(hào)：20170804)ELISA試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；95%乙醇，購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 儀器 臺(tái)式微量高速離心機(jī)(日立工機(jī)株式會(huì)社，型號(hào)CF16RXⅡ);酶標(biāo)儀(InfiniteM200PRO，瑞士Tecan公司)；超純水系統(tǒng)(美國Millipore，型號(hào)ZMQS50F01)。

1.5 方法

1.5.1 3種四逆湯受試物的制備 按各組方十倍量稱取附子，加8倍量蒸餾水煮沸1 h，稱取干姜、炙甘草加入，同時(shí)加入8倍量蒸餾水共煎1 h。過濾，藥渣加6倍量蒸餾水煮沸2 h。過濾，再次加6倍量蒸餾水煮沸1 h。合并3次濾液濃縮至相應(yīng)體積(膿毒癥模型所用各組方均按人和動(dòng)物的體表面積換算為臨床人用量的一倍量，根據(jù)臨床藥效量換算出小鼠用藥典四逆湯劑量為5.2 g生藥/k g，傷寒四逆湯劑量為9 g生藥/kg，吳氏四逆湯為16.9 g生藥/kg；急性毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)將各方水煎液濃縮至能通過小鼠12號(hào)灌胃針頭的最大濃度)。冷卻至室溫，4 ℃冰箱備用。

1.5.2 盲腸結(jié)扎穿孔致小鼠膿毒癥模型的復(fù)制 昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、藥典四逆湯組、傷寒四逆湯組、吳氏四逆湯組。每組雌雄各10只。術(shù)前禁食不禁水12 h，參考文獻(xiàn)方法[5]建立盲腸結(jié)扎穿孔致膿毒癥小鼠模型，KM種小鼠以1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后腹部消毒備皮，無菌條件下沿腹部正中線作1 cm切口，找到盲腸，于盲腸根部至回盲瓣1/3處用4號(hào)手術(shù)縫合線結(jié)扎盲腸，用18號(hào)針穿刺盲腸2次，擠出少量腸內(nèi)容物，隨后將盲腸納入腹腔，縫合手術(shù)切口，小鼠術(shù)后3 h腹部皮下注射25 mg/kg亞胺培南西司他丁鈉作抗感染處理。假手術(shù)組小鼠除盲腸不結(jié)扎和穿刺外，其余操作與手術(shù)組相同。術(shù)后觀察小鼠狀態(tài)，記錄小鼠存活情況。造模后一天開始灌胃給予相應(yīng)的藥物，假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水，連續(xù)給予14 d。

1.5.3 炎癥因子的測(cè)定 末次給藥后2 h，各組小鼠眼底靜脈叢取血約1 mL，靜置2 h，3000 rpm離心10 min，取上清液按照試劑盒操作說明檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.5.4 肺、肝組織HE染色 所有動(dòng)物脫頸椎處死，分離頸部，暴露氣管，從氣管中段剪口，用注射器將10%福爾馬林溶液經(jīng)氣管灌入肺組織中，小心摘除心臟和其他附屬組織，完整取出肺組織。剪開腹腔，取出肝臟組織。取出的組織立即投入盛有10%福爾馬林溶液的固定瓶中浸泡固定。

1.5.4.1 肺組織病理制片 取左肺于常溫下固定48 h后，清水漂洗組織塊2 h后進(jìn)依次放入為75%，86%，95%Ⅰ、Ⅱ的乙醇各30 min，100%Ⅰ、Ⅱ乙醇各20 min進(jìn)行組織脫水，經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min透明后，放入石蠟Ⅰ30 min，石蠟Ⅱ1 h，石蠟Ⅲ2 h浸蠟，然后石蠟包埋，制作成4 μm厚的切片。將切片放入65 ℃的烘箱中烘烤30 min，行HE染色。最后中性樹膠封片，鏡檢。

1.5.4.2 肝組織病理制片 取肝右葉于常溫下固定48 h后，清水漂洗組織塊2 h后進(jìn)行組織脫水。脫水條件如下：依次放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%，85%，95%Ⅰ、Ⅱ的乙醇各1 h，100%Ⅰ、Ⅱ乙醇各30 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，石蠟Ⅰ30 min，石蠟Ⅱ1 h，石蠟Ⅲ2 h，然后石蠟包埋，制作成4 μm的切片。余下步驟與上同。

1.5.5 急性毒性實(shí)驗(yàn) 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，3種四逆湯水煎濃縮液在最大濃度、最大灌胃體積下小鼠灌胃，動(dòng)物無死亡，故進(jìn)行最大給藥量的測(cè)定。取昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組：正常組、藥典四逆湯組、傷寒四逆湯組、吳氏四逆湯組。每組雌雄各10只。試驗(yàn)前禁食不禁水12 h，藥典四逆湯組灌胃給藥劑量為256 g/kg體重，傷寒四逆湯組灌胃給藥劑量為125 g/kg體重，吳氏四逆湯組灌胃給藥劑量為288 g/kg體重，假手術(shù)組給予等體積的生理鹽水，給藥體積為0.4 mL/10g。給藥后連續(xù)觀察14 d，每天觀察各組動(dòng)物的外觀、行為和毒性行為，記錄動(dòng)物的體重、進(jìn)食量。試驗(yàn)第14 d處死、解剖小鼠，觀察其主要臟器的外觀。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 3種四逆湯對(duì)膿毒癥小鼠死亡率的影響 結(jié)果顯示，假手術(shù)組全部存活，造模后少數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)死亡，解剖可見盲腸下端腸與腹壁粘連。3種四逆湯對(duì)小鼠盲腸結(jié)扎穿孔法致膿毒癥模型具有生存保護(hù)作用，可降低小鼠死亡率。各組動(dòng)物死亡情況見表1。

表1 3種四逆湯對(duì)膿毒癥小鼠死亡率的影響 (n=20)

注：死亡率(%)=死亡數(shù)/(死亡數(shù)+存活數(shù))。

2.2 3種四逆湯對(duì)膿毒癥小鼠血清炎癥因子的影響 結(jié)果顯示，小鼠盲腸結(jié)扎穿孔法致膿毒癥模型建立后，血清中炎癥因子明顯增高；給予3種四逆湯干預(yù)后，吳氏四逆湯可明顯減少模型動(dòng)物血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，藥典四逆湯可明顯減少血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量，傷寒四逆湯僅可明顯減少炎癥因子TNF-α的含量結(jié)果見表2、圖1。

表2 3種四逆湯對(duì)膿毒癥小鼠血清炎癥因子的影響

注：與正常組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

2.3 3種四逆湯對(duì)膿毒癥小鼠肺組織損傷的影響

假手術(shù)組顯示肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔干凈。模型組小鼠肺組織內(nèi)均可見肺泡壁內(nèi)、肺泡腔內(nèi)細(xì)胞增多，主要為肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多，肺泡壁明顯增厚，炎癥明顯。藥典四逆湯組、傷寒四逆湯組、吳氏四逆湯組細(xì)胞增生情況較模型組減輕，見圖2。

各組肺切片均可見少量的肺泡內(nèi)出血現(xiàn)象，各組之間在出血量、出血部位等方面均無明顯差異，考慮此肺泡內(nèi)出血與頸椎脫臼處死方式有關(guān)，頸椎脫臼可使頸部氣管受損，從而出血，血液自然下流或氣管內(nèi)注射固定液均可將血液帶入肺泡腔內(nèi)。

2.4 3種四逆湯對(duì)膿毒癥小鼠肝臟損傷的影響 假手術(shù)組顯示肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝索排列規(guī)則，匯管區(qū)干凈。模型組炎性細(xì)胞浸潤明顯，有多個(gè)散在的肝細(xì)胞小灶性的變性壞死。藥典四逆湯組、傷寒四逆湯組、吳氏四逆湯組肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，肝細(xì)胞變性較輕，有輕微的炎性浸潤，偶見點(diǎn)狀壞死，見圖3。

2.5 3種四逆湯經(jīng)口給予小鼠的急性毒性的影響 結(jié)果顯示，給藥后14 d內(nèi)，藥典四逆湯組和吳氏四逆湯組動(dòng)物未見死亡，一般狀況良好，飲食、二便正常，且外觀、皮毛、行為、呼吸均正常，鼻、眼、口腔無異常分泌物，未見其它明顯異常反應(yīng)。各給藥組與正常組的體重增長變化趨勢(shì)基本一致，進(jìn)食量隨體重的增長而增加。傷寒四逆湯組動(dòng)物在給藥12 h內(nèi)有些微腹瀉情況，第3天即恢復(fù)正常，但未見死亡。試驗(yàn)結(jié)束后觀察各組主要臟器無明顯異常，表明3種四逆湯在常規(guī)劑量下使用是安全的。小鼠單次給藥的最大給藥量：吳榮祖教授經(jīng)驗(yàn)方四逆湯(288 g生藥/kg)>《中國藥典》收錄四逆湯(256 g生藥/kg)>《傷寒論》記載四逆湯(125 g生藥/kg)。

5 討論

四逆湯是溫補(bǔ)心腎，通脈止痛的代表方，臨床應(yīng)用廣泛，可治療多種休克、冠心病、心絞痛等疾病，均具有顯著療效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明該方具有強(qiáng)心、抗休克、抗心肌缺血、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。該方應(yīng)用雖廣，但各家用四逆湯時(shí)附子的用法和用量差異較大，而藥效學(xué)及毒性是否有差異尚不清楚，需深入探究附子的用法和用量對(duì)該方作用影響，為臨床安全有效用藥提供理論依據(jù)。

膿毒癥是一種嚴(yán)重的臨床疾病，是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，在過去30年中，盡管最新研究表明抗生素治療和重癥監(jiān)護(hù)取得了進(jìn)展[6]，但其病死率仍高達(dá)30%～50%，已成為住院和醫(yī)療費(fèi)用的主要原因之一[7]，探索規(guī)范和有效的治療手段和藥物，實(shí)屬當(dāng)務(wù)之急，也無疑具有重要的理論價(jià)值及臨床意義。從癥狀學(xué)的角度來看，《傷寒論》中四逆湯諸證與膿毒癥的臨床癥狀十分相似，而多項(xiàng)臨床及藥理研究亦表明，四逆湯對(duì)各類休克具有一定的治療作用，但以往開展的與其作用機(jī)制相關(guān)的藥理研究主要集中于強(qiáng)心和改善微循環(huán)等方面，均不能很好解釋其回陽救逆功效的內(nèi)涵。近年來的研究表明，細(xì)胞因子激活是宿主對(duì)感染的防御反應(yīng)的一部分，但過度分泌和分泌細(xì)胞因子會(huì)引起廣泛的組織損傷和器官衰竭[8]。TNF-α和IL-6參與了膿毒癥引起的組織損傷，被認(rèn)為是膿毒癥或膿毒性休克等嚴(yán)重炎癥疾病的主要調(diào)節(jié)因子[8-9]。IL-1β是膿毒癥時(shí)促炎反應(yīng)的主要炎癥因子[10]，可以直接反映動(dòng)物機(jī)體受損的嚴(yán)重程度。在本實(shí)驗(yàn)中，3種四逆湯對(duì)小鼠盲腸結(jié)扎穿孔法致膿毒癥模型具有生存保護(hù)作用，降低小鼠死亡率。同時(shí)，3種四逆湯均可不同程度降低小鼠膿毒癥模型血清中炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6的水平，抑制炎癥反應(yīng)。吳榮祖教授經(jīng)驗(yàn)方四逆湯重用附子，在本實(shí)驗(yàn)研究中顯示其對(duì)TNF-α，IL-1β，IL-6三個(gè)炎癥因子均顯示了明顯的抑制作用，其中以抑制炎癥因子TNF-α的作用更為明顯。

為進(jìn)一步比較3種四逆湯急性毒性的差異，本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠進(jìn)行了經(jīng)口給藥的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究。在最大濃度、最大灌胃體積下給予小鼠灌胃，小鼠未出現(xiàn)死亡及明顯毒性反應(yīng)，故測(cè)定其經(jīng)口給藥的最大給藥量。給藥后小鼠一般狀況良好，飲食、二便均正常，無異常分泌物。小鼠單次給藥的最大給藥量：吳榮祖教授經(jīng)驗(yàn)方四逆湯(288 g生藥/kg)>《中國藥典》收錄四逆湯(256 g生藥/kg)>《傷寒論》記載四逆湯(125 g生藥/kg)，吳氏四逆湯小鼠經(jīng)口給藥的最大給藥量為臨床成人用量的155倍，提示臨床用藥是安全的。

通過本實(shí)驗(yàn)的研究，提示，四逆湯中附子的用法和用量的不同在藥效學(xué)及安全性方面可產(chǎn)生一定的差異，但由于本實(shí)驗(yàn)在藥效學(xué)方面僅對(duì)膿毒癥模型進(jìn)行了考察，在四逆湯的其它藥效學(xué)方面的差異尚需進(jìn)行大量深入系統(tǒng)的比較研究。