文/王玉堂

上接2019年4期

八、魚類基因工程抗菌肽的研究

迄今為止，應(yīng)用于生產(chǎn)中的抗菌肽主要有四種獲取方式：一是天然提取法，即直接從動(dòng)植物個(gè)體中提取，但來源有限。二是化學(xué)合成法，即通過連接氨基酸殘基合成抗菌肽，一般小于10個(gè)氨基酸殘基的多肽合成較為經(jīng)濟(jì)，10個(gè)以上氨基酸殘基的多肽合成較為昂貴。三是酶解法，即利用水解酶本身不具有活性的蛋白質(zhì)，使其成為具有活性的肽鏈。四是基因工程方法，即利用分子生物學(xué)手段，通過原核或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽目的基因。采用基因工程方法生產(chǎn)抗菌肽具有成本低、易于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)，是目前國內(nèi)外研究者的首選?；蚬こ炭咕牡难芯恐饕性趦蓚€(gè)方面：一是在分子水平上研究抗菌肽在動(dòng)物免疫防御系統(tǒng)中的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制，為抗菌肽相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)利用提供理論依據(jù)；二是克隆抗菌肽基因，利用微生物系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，然后利用蛋白質(zhì)操作技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行收集和提純。

（一）原核系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽的研究

大腸桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng)是迄今為止在基因工程領(lǐng)域應(yīng)用最多和最完善的系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)具有成本低、產(chǎn)量高、易于操作等優(yōu)點(diǎn)；缺點(diǎn)是抗菌肽對(duì)原核表達(dá)細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷力，所以有時(shí)采用融合表達(dá)方式。李偉等（2007）從大菱鲆肝臟中鑒定得到hepcidin抗菌肽基因，并構(gòu)建了谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶抗菌肽（GST2-hep）融合表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的融合表達(dá)。張虹等從斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟中克隆了抗菌肽（LEAP-2），構(gòu)建了“PET32a-IpL-2”的重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，得到可溶性融合抗菌肽產(chǎn)物。

雖然融合表達(dá)能增加抗菌肽在表達(dá)過程中的穩(wěn)定性，但是，融合標(biāo)簽的存在可能會(huì)影響到抗菌肽本身的天然活性。

汪開毓等（2 0 1 8）就斑點(diǎn)叉尾鮰7種常見抗菌肽：Hepcidin，liver-expressedAMP2（LEAP2），bactericidal permeability-in-creasing protein(BPI)，cathepsin D，NK-ly-sin typel，NK-lysin type2，NK-lysin type3進(jìn)行研究，通過生物信息學(xué)軟件對(duì)7種抗菌肽進(jìn)行分析，并對(duì)其功能片段進(jìn)行克隆，隨后將目的片段融合于PTWINI（含幾丁質(zhì)標(biāo)簽和內(nèi)含肽）表達(dá)載體內(nèi)含肽的N端，通過摸索誘導(dǎo)條件使內(nèi)含肽與目的蛋白質(zhì)之間的肽鍵斷裂，從而獲得不含任何標(biāo)簽蛋白質(zhì)的抗菌肽。目前，該試驗(yàn)已成功構(gòu)建了幾種抗菌肽的重組質(zhì)粒PTWINIAMP，若能成功地將表達(dá)的抗菌肽與融合標(biāo)簽分離開來，將會(huì)對(duì)抗菌肽的后續(xù)研究有重要意義。

采用原核表達(dá)系統(tǒng)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)抗菌肽的高效表達(dá)，但也存在諸多問題。首先就是抗菌肽的宿主細(xì)胞毒性。宿主細(xì)胞表達(dá)的抗菌肽：一是會(huì)反饋性地抑制宿主細(xì)胞增殖，從而影響抗菌肽的進(jìn)一步表達(dá)。二是容易被降解，由于抗菌肽在表達(dá)過程中對(duì)蛋白質(zhì)酶非常敏感，抗菌肽本身帶有大量正電荷，在宿主細(xì)胞中容易被降解，難以實(shí)現(xiàn)大量表達(dá)。三是大腸桿菌缺乏翻譯后修飾加工機(jī)制，表達(dá)的蛋白質(zhì)不能進(jìn)行正確的折疊，常以包涵體形式上存在，影響生物活性，需要進(jìn)行變性、復(fù)性等復(fù)雜操作才能得到活性蛋白質(zhì)，有時(shí)不適合表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)。因此，在原核表達(dá)方面，如何保持其結(jié)構(gòu)與活性的同時(shí)，降低其細(xì)胞毒性是急需解決的問題。

（二）真核系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽的研究

酵母作為工程菌表達(dá)外源蛋白質(zhì)技術(shù)是近年來日益增長發(fā)展起來的真核表達(dá)體系。酵母作為低等真核生物具有細(xì)胞生長快、營養(yǎng)要求低、易于規(guī)模化生產(chǎn)、遺傳操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工、修飾及合理的空間折疊，不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，有雌酵母的表達(dá)產(chǎn)物分泌于胞外，既可以減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷，又可減少宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)酶對(duì)外源蛋白質(zhì)的降解，提高蛋白質(zhì)表達(dá)活性，可獲得較高的表達(dá)量，利于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，非常有利于對(duì)真核生物基因的表達(dá)。

雖然酵母表達(dá)系統(tǒng)是抗菌肽基因應(yīng)用最為理想的表達(dá)系統(tǒng)之一，但也受到宿主菌狀態(tài)、轉(zhuǎn)化基因表達(dá)效率、內(nèi)源蛋白質(zhì)酶活性等諸多因素的影響，其表達(dá)結(jié)果不理想的報(bào)道也常見。因此，抗菌肽是否適合酵母中表達(dá)，需要根據(jù)其活性特點(diǎn)具體分析，針對(duì)不同類型采取不同策略來構(gòu)建表達(dá)載體，從而實(shí)現(xiàn)抗菌肽的高效高質(zhì)表達(dá)。

隨著魚類相關(guān)文庫和蛋白質(zhì)表達(dá)譜的建立以及基因工程技術(shù)的發(fā)展，表達(dá)和利用抗菌肽基因?qū)?huì)更加方便。天然抗菌肽基因經(jīng)過有目的地人工設(shè)計(jì)和改造，可以生產(chǎn)穩(wěn)定性更高、活性更強(qiáng)的抗菌肽，對(duì)抗菌肽基因篩選、改造設(shè)計(jì)以及表達(dá)載體篩選方面的深入研究，可提高基因表達(dá)的高效性和穩(wěn)定性，基因工程抗菌肽替代天然抗菌肽在理論和實(shí)踐上是完全可行的。

九、抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中存在的問題及未來研究重點(diǎn)

（一）存在問題

雖然人們對(duì)抗菌肽的分離、結(jié)構(gòu)和功能研究逐漸深入，但實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的產(chǎn)品較少。因?yàn)樵趹?yīng)用領(lǐng)域還存在許多問題。

1.商業(yè)化生產(chǎn)難度大

因?yàn)榭咕闹饕怯缮餀C(jī)體自身產(chǎn)生，含量低，從生物體中分離和提純難度大。研究表明，可通過營養(yǎng)調(diào)控來控制內(nèi)源抗菌肽的表達(dá)，利用維生素D3是最主要的手段。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸、鋅、多糖和精氨酸等也可以對(duì)抗菌肽的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用。但是，這種營養(yǎng)調(diào)控手段還研究得不夠深入和全面，能達(dá)到治療效果的產(chǎn)品有限。人工合成方法雖然能解決抗菌肽量化生產(chǎn)問題，但生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量低，活性或功效低等。

利用基因工程技術(shù)進(jìn)行抗菌肽基因表達(dá)以降低生產(chǎn)成本和提高產(chǎn)量，可以達(dá)到量化生產(chǎn)的目標(biāo)，這也是目前人們研究的重點(diǎn)。在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)中，根據(jù)不同種類抗菌肽的特點(diǎn)，選擇和優(yōu)化抗菌肽表達(dá)系統(tǒng)至關(guān)重要。但是，抗菌肽具體結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)，體外合成的抗菌肽與天然抗菌肽雖然一級(jí)結(jié)構(gòu)一致，但空間結(jié)構(gòu)存在一定差異，往往活性較差，因此，基因工程合成抗菌肽與天然抗菌肽的功能差異還有待于進(jìn)一步研究。

2.天然抗菌肽的生物活性低

天然抗菌肽的生物活性低、效果不理想，穩(wěn)定性差，容易被蛋白酶水解。如何提高天然抗菌肽活性是一大難題。有科研人員采用生物化學(xué)方法對(duì)抗菌肽的分子結(jié)構(gòu)等進(jìn)行改造，利用構(gòu)效原則來提高其生物活性和穩(wěn)定性。現(xiàn)階段主要有以下四種方法：嵌全形成雜全肽；利用生物化學(xué)手段改造天然抗菌肽；載取天然抗菌肽活性片段；通過肽文庫與計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行高能量篩選。

目前，抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物上的應(yīng)用產(chǎn)品和產(chǎn)量還較少，大量的研究主要集中在其作為飼料添加劑來增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物的免預(yù)防作用，雖然這些研究取得一些進(jìn)展，但大都是采用其它物種的抗菌肽作為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的飼料添加劑，雖有一定效果，但具有“種屬”專一性或特異性的抗菌肽對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的強(qiáng)效和更多的小副作用等問題還有待于進(jìn)一步研究。

魚類的抗菌肽種類很多，哪些種類具有更好的療效和更好的經(jīng)濟(jì)性需要進(jìn)一步探索?？咕牡母弊饔脝栴}也有待于進(jìn)一步研究。姜珊等發(fā)現(xiàn)抗菌肽添加過量會(huì)導(dǎo)致羅非魚的增重率下降，這可能是因?yàn)楦邼舛鹊目咕臅?huì)抑制羅非魚腸道中有益菌群的生長，從而影響動(dòng)物的消化吸收功能。由于抗菌肽抗菌譜廣、殺傷力強(qiáng)，對(duì)宿主細(xì)胞甚至也有一定的毒性，如何在保持其結(jié)構(gòu)與活性的同時(shí)降低其細(xì)胞殺傷力需要到時(shí)候深入的研究。

3.抗菌肽并不是抗生素

有些人對(duì)抗菌肽了解和認(rèn)識(shí)不深，擔(dān)心抗菌肽會(huì)產(chǎn)生抗菌素樣作用以及細(xì)菌耐藥性等問題。其實(shí)，抗菌肽與抗生素是有本質(zhì)區(qū)別的。

（1）來源不同?？股厥怯晌⑸铮?xì)菌、真菌、放線菌等）在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，如青霉素來源于青霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。而抗菌肽是指生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的多肽物質(zhì)。

（2）生產(chǎn)方式不同?？股厥且幌盗忻复俜磻?yīng)產(chǎn)物。而抗菌肽是通過基因編碼合成，由DNA到RNA到蛋白質(zhì)（多肽），合成迅速。

（3）對(duì)機(jī)體的免疫作用不同。許多抗生素不能提高機(jī)體免疫力，甚至還對(duì)免疫有抑制或損傷作用。而抗菌肽為宿主防制性肽，在宿主先天免疫系統(tǒng)中有重要的調(diào)節(jié)作用，能提高機(jī)體的非特異性免疫能力。

（4）抗病原生物活性不同。抗生素主要是抗菌作用，而抗菌肽具有多種生物活性，除對(duì)細(xì)菌的抑制或殺滅作用外，對(duì)真菌、病毒、原生蟲都有一定的抑制或殺滅作用。

（5）抗菌機(jī)制不同?？股卮蠖嗍峭ㄟ^抑制細(xì)菌細(xì)胞壁或DNA的合成而發(fā)揮作用，通常有特定的作用位點(diǎn)，與細(xì)菌細(xì)胞膜上或胞內(nèi)特異的靶位結(jié)合，且靶位類型有限，細(xì)菌容易通過變異產(chǎn)生耐藥性。而抗菌肽主要作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜上，通過與細(xì)細(xì)胞膜相互作用改變脂雙層膜構(gòu)造，造成膜的物理性損傷，破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，致使細(xì)菌死亡而起到殺菌作用?？咕牡淖饔貌簧婕疤囟ò形?，完全是陰陽離子的物理作用，由于細(xì)菌表面的結(jié)構(gòu)和帶電性能無法改變，因此而很難產(chǎn)生抗藥性。

（二）未來研究重點(diǎn)

由于抗菌肽替代抗生素的研究是近幾年才發(fā)展起來的，雖然取得了一定進(jìn)展，但還處于探索階段，距離技術(shù)成熟、大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用到動(dòng)物養(yǎng)殖中還有很多需要解決的問題。一是抗菌肽的種類很多，哪些種類作為飼料添加劑時(shí)效果好，又比較經(jīng)濟(jì)。二是不同種類的抗菌肽之間的相互作用情況。三是抗菌肽在動(dòng)物體內(nèi)的含量較少，天然資源匱乏，化學(xué)合成的成本太高，目前還無法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)；需要從基因工程技術(shù)方法方面研究如何大規(guī)模生產(chǎn)抗菌肽，或通過日糧因素調(diào)控抗菌肽基因的表達(dá)。四是抗菌肽在動(dòng)物體內(nèi)容易被蛋白酶水解，需用脂質(zhì)包被或?qū)ζ溥M(jìn)行化學(xué)修飾保護(hù)，這需要對(duì)其釋放機(jī)制、受體結(jié)合、降解活性及其類似物的結(jié)構(gòu)與活性等進(jìn)行研究。五是目前對(duì)抗菌肽作為飼料添加劑真正在實(shí)際生產(chǎn)方面的試驗(yàn)還較少，其效果及是否有副作用還需進(jìn)一步研究證實(shí)。