尤從彪，劉添泰，王 斐

（1.涼州區(qū)畜牧獸醫(yī)局，甘肅 武威 733000；2.甘肅新天馬制藥股份有限公司，武威 733000；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，蘭州 730070）

乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，通常由侵入乳腺及乳導(dǎo)管內(nèi)的病原菌引起，偶見化學(xué)性、機(jī)械性及乳房熱損傷病例。根據(jù)病理表現(xiàn)可分為漿液性乳房炎、纖維素性乳房炎、化膿性乳房炎、出血性乳房炎、壞疽性乳房炎，根據(jù)臨床觀點(diǎn)可分為臨床型和亞臨床性（隱性）。乳房炎是導(dǎo)致泌乳牛產(chǎn)奶量下降最主要的原因之一，通常會(huì)引起乳汁質(zhì)量降低［1］、泌乳減少或停止，甚至?xí)?dǎo)致慢性感染奶牛的淘汰和死亡［2-4］，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，及時(shí)了解本地養(yǎng)殖場(chǎng)乳房炎的感染情況，掌握主要病原菌的耐藥情況，是畜牧獸醫(yī)監(jiān)管部門的必要工作，也是為當(dāng)?shù)啬膛．a(chǎn)業(yè)保駕護(hù)航的重要措施。

目前國內(nèi)關(guān)于奶牛乳房炎主要病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)的研究非常普遍，相關(guān)研究結(jié)果對(duì)乳房炎的預(yù)防、診斷及治療有著十分重要的作用。但引起奶牛乳房炎病原菌的種類和分布情況往往與地區(qū)環(huán)境有關(guān)，同時(shí)，該地區(qū)此前的用藥史也是影響病原菌耐藥性的重要因素。如果不能根據(jù)病原菌的實(shí)際耐藥性進(jìn)行治療，不但可能貽誤病情、無法及時(shí)控制乳房炎，更有可能引發(fā)更為嚴(yán)重的病原菌耐藥性和獸藥殘留的問題［5］，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生及奶制品食品安全。目前，尚未有甘肅省武威市涼州區(qū)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)乳房炎發(fā)病情況的調(diào)查和研究。因此，本研究對(duì)該地區(qū)的1 000頭中國荷斯坦奶牛進(jìn)行了乳房炎調(diào)查、細(xì)菌學(xué)鑒定及藥敏試驗(yàn)，為今后涼州區(qū)奶牛乳房炎的預(yù)防、診斷和治療及流行病學(xué)調(diào)查和主要病原菌耐藥性的研究提供可靠的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源

甘肅省武威市涼州區(qū)5個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)共計(jì)1 000頭奶牛，年齡2～6歲，均為經(jīng)產(chǎn)母牛。

1.2 材料

蘭州奶牛隱性乳房炎診斷液（LMT）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所提供。藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品。

培養(yǎng)基：0.5%綿羊全血瓊脂平板、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為北京陸橋生物有限公司產(chǎn)品；水解酪蛋白瓊脂（MH）購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 奶樣采集及LMT檢測(cè) 采集前，對(duì)奶牛乳房、乳頭及擠奶人員的手部清洗后，用酒精棉消毒。采集時(shí)，棄去前三把奶，取不同乳區(qū)奶樣，分別加入LMT檢驗(yàn)皿的4個(gè)小盤內(nèi)，并傾斜檢驗(yàn)皿倒出多余乳樣，每個(gè)小盤約剩余奶樣2 mL；每個(gè)小盤內(nèi)再加入LMT檢驗(yàn)液2 mL，平穩(wěn)搖動(dòng)檢驗(yàn)皿充分混勻，約10 s后觀察混合物性狀（表1）。采集檢出結(jié)果為陽性的奶樣，置于經(jīng)高壓滅菌的10 mL離心管中，標(biāo)明所采樣品的編號(hào)、日期等，冷藏并盡快運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

表1奶牛亞臨床性CMT標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 臨床型乳房炎診斷 奶牛乳房腫脹、熱、發(fā)紅；觸診時(shí)存在明顯腫塊，奶牛表現(xiàn)出明顯疼痛，對(duì)犢?；驍D奶人員有抵觸現(xiàn)象；擠奶時(shí)可見牛奶性狀發(fā)生眼觀變化，質(zhì)地稀薄，存在片狀或塊狀凝固物，混有炎性膿液，偶見鮮血（表2）。嚴(yán)重者可伴隨全身病理性變化，包括體溫升高、精神沉郁、食欲不振、反芻頻率降低等。

表2正常牛奶與臨床型乳房炎牛奶的對(duì)比

1.3.3 細(xì)菌分離純化 將采集的樣品搖勻，挑取少許接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中增菌培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h。取生長(zhǎng)良好的樣品劃線接種于綿羊全血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄菌落生長(zhǎng)形態(tài)及溶血狀況。挑取生長(zhǎng)特性及形態(tài)不同的單個(gè)菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。細(xì)菌菌液，分別進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，挑取鏡檢涂片無雜菌者，涂劃血斜面，37℃培養(yǎng)24 h后低溫保存。

1.3.4 細(xì)菌生化特性鑒定 根據(jù)染色鏡檢初步鑒定結(jié)果，對(duì)分離到的菌株進(jìn)行如下生化試驗(yàn)。

在麥康凱瓊脂平板上菌落為粉紅色、在伊紅美藍(lán)瓊脂上產(chǎn)生黑色帶金屬閃光的菌株進(jìn)行如下生化試驗(yàn)：V-P實(shí)驗(yàn)、枸櫞酸鹽、甲基紅和吲哚實(shí)驗(yàn)、三糖鐵斜面培養(yǎng)。三糖鐵發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，且符合吲哚（+/-）、甲基紅（+）、V（-）、枸櫞酸鹽發(fā)酵試驗(yàn)（-）的菌種即可鑒定為大腸埃希氏菌（Escherichia coli）。

在肉湯中生長(zhǎng)渾濁一致、鏡檢結(jié)果為葡萄球菌屬的菌株進(jìn)行如下生化試驗(yàn)：觸酶試驗(yàn)、兔血漿凝固酶試驗(yàn)、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)。觸酶試驗(yàn)陽性、凝固酶試驗(yàn)陽性且在需氧和厭氧環(huán)境下甘露醇都能發(fā)酵的菌種即可鑒定為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

在血瓊脂平板上菌落較小、溶血，且鏡檢成不同程度鏈狀的菌株（鏈球菌屬，Streptococcus spp.）進(jìn)行如下生化試驗(yàn)：CAMP試驗(yàn)、七葉苷水解試驗(yàn)、馬尿酸鈉水解試驗(yàn)和6.5%NaCl肉湯生長(zhǎng)試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果區(qū)分無乳鏈球菌（Str.agalactiae）、停乳鏈球菌（Str.dysgalactiae）、乳房鏈球菌（Str.uberis）和糞鏈球菌（又名糞腸球菌，Enterococcus faecalis）（表 3）。

表3病原鏈球菌生化特性

1.3.5 藥物敏感性檢測(cè)（紙片擴(kuò)散法） 對(duì)分離出的主要病原菌按不同屬分別進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)。采用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）［6］：將分離純化的細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18～24 h；用生理鹽水稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)比濁管濁度相當(dāng)；接種于MH瓊脂平板上，每個(gè)平板上放置5個(gè)藥敏紙片；每個(gè)菌種設(shè)置3個(gè)重復(fù)；37℃培養(yǎng)18～20 h后測(cè)定細(xì)菌抑菌環(huán)的直徑。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的標(biāo)準(zhǔn)，判定病原菌對(duì)藥物的敏感性（表3）。

藥敏紙片：青霉素（penicillin，Pen），氨芐西林（ampicillin，Amp），頭孢唑林（cefazolin，Caf），慶大霉素（gentamicin，Gen），鏈霉素（streptomycin，Str），諾氟沙星（norfloxacin，Nof），氧氟沙星（ofloxacin，Ofl），復(fù)方新諾明（SMZ-TMP），氯霉素（chloramphenicol，Chl），紅霉素（erythrocin，Ery），四環(huán)素（tetracycline，Tet），卡那霉素（kanamycin，Kan）。

表4 CLSI藥敏紙片法結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)mm

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳房炎發(fā)病情況

共檢測(cè)武威市涼州區(qū)1 000頭奶牛3 991份奶樣，其中CMT陽性奶樣1 456份，來自365頭奶牛，奶牛亞臨床性乳房炎發(fā)病率36.50%；臨床型乳房炎奶樣728份，來自182頭奶牛，奶牛臨床型乳房炎發(fā)病率18.20%；總感染率54.70%，陽性乳區(qū)率54.72%（表5）。

表5涼州區(qū)部分養(yǎng)殖場(chǎng)奶牛乳房炎發(fā)病率

2.2 主要病原菌分離鑒定

分別取臨床型乳房炎和亞臨床型乳房炎奶樣各400份，分離純化病原菌。其中655份奶樣中只分離出一種病原菌，69份奶樣中分離出兩種病原菌；分離出3種及3種以上病原菌的奶樣棄之。

不同類型乳房炎奶樣中分離出的主要病原菌均為金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌及鏈球菌屬細(xì)菌，但各自占比不同。在臨床型乳房炎奶樣中共分離得到412株病原菌，以鏈球菌屬最多，共224株（54.37%），金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌分別為121株（29.37%）和49株（11.89%）；而亞臨床型乳房炎奶樣中共分離得到381株病原菌，其中金黃色葡萄球菌最多，共185株（48.56%），鏈球菌屬次之，共84株（22.05%），大腸埃希氏菌依然最少，共71株（18.64%）（表6）。

表6涼州區(qū)部分養(yǎng)殖場(chǎng)奶牛乳房炎主要病原菌

通過生化試驗(yàn)共分離鑒定出無乳鏈球菌161株、停乳鏈球菌80株、乳房鏈球菌132株、糞鏈球菌27株、其他鏈球菌9株。同樣，在不同類型乳房炎奶樣中鏈球菌的分布也不相同（表7）。

2.3 藥敏試驗(yàn)

共對(duì)308株鏈球菌、306株金黃色葡萄球菌和120株大腸埃希氏菌分別進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。因分離所得鏈球菌均為β溶血型，故合并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示：鏈球菌對(duì)青霉素、氨芐西林、紅霉素和四環(huán)素耐藥性較強(qiáng)，對(duì)氧氟沙星和氯霉素較敏感；金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素、四環(huán)素、紅霉素耐藥性較強(qiáng)，對(duì)復(fù)方新諾明耐藥性較弱，對(duì)諾氟沙星、氧氟沙星、慶大霉素較敏感；大腸埃希氏菌對(duì)四環(huán)素、鏈霉素、氨芐西林、頭孢唑林、復(fù)方新諾明有一定的耐藥性，對(duì)慶大霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、氯霉素敏感（表8）。其中，部分菌種表現(xiàn)多重耐藥性（表9）。

表7不同乳房炎中的鏈球菌分布情況

表8涼州區(qū)部分養(yǎng)殖場(chǎng)奶牛乳房炎主要病原菌藥敏試驗(yàn)

表9分離病原菌的多重耐藥性

3 討論

奶牛乳房炎是由物理、化學(xué)或微生物等因素刺激奶牛乳腺所引發(fā)的一種炎癥反應(yīng)，多種病原微生物的感染是引起奶牛乳房炎的主要病因，其中主要的病原菌是大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌等［7-9］。該病廣泛存在于世界各地，發(fā)生率一直相當(dāng)高［10-12］。它不僅僅給世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也給乳品工業(yè)的發(fā)展、公共衛(wèi)生以及食品安全帶來一定隱患。本次對(duì)涼州區(qū)1 000頭泌乳奶牛乳房炎的流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明，臨床型乳房炎發(fā)病率18.20%，亞臨床型乳房炎發(fā)病率36.50%，奶牛陽性率54.70%，乳區(qū)陽性率54.72%，與其他地區(qū)乳房炎的流行趨勢(shì)基本一致［13-15］。但主要病原菌的流行情況略有差異，其他部分地區(qū)以鏈球菌屬為主［16］，也有些地區(qū)以金黃色葡萄球菌為主［17-18］。本研究中，共分離出793株病原菌，其中臨床型乳房炎奶樣中以鏈球菌屬最多（54.37%），而亞臨床型中則以金黃色葡萄球菌為主（48.56%）。病原性乳房炎的發(fā)生主要與飼養(yǎng)及擠奶過程中的消毒和清潔工作有關(guān)，擠奶人員、設(shè)施及奶牛乳房消毒不徹底會(huì)導(dǎo)致交叉感染和二次感染。尤其是金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌，都屬于環(huán)境性病原體，在飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生狀況良好的情況下，一般不會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，日常的飼養(yǎng)管理中，搞好環(huán)境衛(wèi)生、注意清潔消毒對(duì)于預(yù)防和減少奶牛乳房炎的發(fā)生有著重要意義。

在耐藥性試驗(yàn)中，鏈球菌和金黃色葡萄球菌都對(duì)青霉素極耐藥，耐藥率分別達(dá)到了61.04%和64.38%；此外，這兩類病原菌還對(duì)紅霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明表現(xiàn)出了一定的耐藥性，尤其是金黃色葡萄球菌，對(duì)四環(huán)素的耐藥率高達(dá)40.52%。不過，鏈球菌對(duì)氧氟沙星的耐藥率極低，僅為0.97%；金黃色葡萄球菌對(duì)諾氟沙星、氧氟沙星復(fù)方新諾明耐藥性較低（＜10%），對(duì)慶大霉素、氯霉素、卡那霉素敏感。大腸埃希氏菌則對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、鏈霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明的耐藥性較強(qiáng)，對(duì)慶大霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、卡那霉素敏感。因此，綜合3種主要病原菌的耐藥譜，建議涼州區(qū)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)在防治乳房炎時(shí)應(yīng)避免使用β-內(nèi)酰胺類、紅霉素類、四環(huán)素類藥物，以免發(fā)生“藥量大、療效微”的抗生素濫用，也避免進(jìn)一步增強(qiáng)該地區(qū)乳房炎主要病原菌的耐藥性，同時(shí)減少不合理使用抗生素帶來的奶制品內(nèi)抗生素殘留問題。推薦喹諾酮類、慶大霉素類藥物為適用藥物，及時(shí)有效地對(duì)奶牛乳房炎進(jìn)行治療，切實(shí)保障涼州區(qū)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全、動(dòng)物性食品安全、公共衛(wèi)生安全和生態(tài)環(huán)境安全。