張 梅，胡 瑾，周 艷，李君一2，馮佑鴻，李依蔓

(1.貴州省植物園，貴陽 550004； 2.貴州省林業(yè)科學研究院，貴陽 550005)

兜蘭屬(Paphiopedilum)隸屬于蘭科(Orchidaceae)植物，全世界有80～85種，以亞洲的亞熱帶和熱帶地區(qū)的分布為主，太平洋西南的大洋洲島嶺、南洋群島、巴布亞新幾內(nèi)亞、東南亞等為分布中心[5,7-8,17]。我國擁有豐富的兜蘭屬植物資源，有30種以上，主要分布在我國西南部的亞熱帶地區(qū)和熱帶邊緣地區(qū)，以廣西、云南和貴州分布最多[9-11,28]。大部分種類的兜蘭分布范圍較狹窄，具有一定的區(qū)域特征，如白花兜蘭僅產(chǎn)廣西和貴州極其狹窄的喀斯特林下[22]。

白花兜蘭(Paphiopedilumemersonii)是我國特有種，國家Ⅰ級保護植物，已被列入《野生動植物瀕危物種國際貿(mào)易公約》(CITES)以及紅色名錄(IUCN Red List of Threatened Species)[4,6]。隨著人口的迅速增長，人類活動和經(jīng)濟活動也不斷的加劇，地球綠色植被覆蓋面積在不斷的減少，整個大生態(tài)系統(tǒng)每況愈下，白花兜蘭的生長環(huán)境在不斷的萎縮和消失。而白花兜蘭生境主要是喀斯特林下，分布區(qū)域狹窄，且喀斯特地貌的氣候異常。生境的特殊性和不可逆性，加上掠奪性采挖，導致種群數(shù)量迅速減少而瀕臨滅絕[6]。因此，探尋白花兜蘭的快速繁殖方法和人工繁育途徑對白花兜蘭以及整個兜蘭屬的保護和開發(fā)具有重要的意義。

兜蘭同其他大多數(shù)蘭花一樣，種子無胚乳，在自然環(huán)境中需要與真菌共生才能萌發(fā)，且萌發(fā)率極低，其傳統(tǒng)繁殖為分株繁殖，繁殖系數(shù)低，速度慢，不能滿足保護和開發(fā)的需求[23]。在前期的研究中，本項目組采用白花兜蘭的葉片和莖尖作為外植體，通過常規(guī)消毒仍被大量的細菌、真菌和其他病源菌感染，而無污染的外植體啟動增長速度慢。為了提高白花兜蘭的繁殖能力，本實驗擬用其種子和原球莖作為外植體，探索白花兜蘭有效的繁殖方式，為白花兜蘭的保護、利用和開發(fā)提供理論基礎和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料均取自貴州省植物園溫室內(nèi)的蘭科植物，為授粉后結(jié)果180 d且未開裂的白花兜蘭種子和在溫室中健康茁壯的原球莖植株。

1.2 實驗方法

1.2.1組培室的培養(yǎng)條件

組培室的培養(yǎng)溫度控制在(24±1)℃，光照2 000 lx，光照時間12 h/d。培養(yǎng)基中含蔗糖3.0%，瓊脂0.8%，pH值控制在5.6～6.0范圍內(nèi)。

1.2.2種子和原球莖的處理

將采收的未開裂蒴果和健康且茁壯生長植株的原球莖用自來水洗凈，再用流水沖洗15 min，然后在超凈工作臺(超凈工作臺在操作前先開紫外滅菌燈滅菌15 min)上先用75%酒精浸泡30 s，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液中浸泡20 min，再用無菌蒸餾水清洗5～6遍，取出未開裂的蒴果和原球莖，用無菌濾紙吸干水分，用無菌剪刀和鑷子剖開未開裂的蒴果和原球莖，均勻地播撒在培養(yǎng)基表面(注：操作過程要小心，避免被污染和升汞溶液撒落，操作完成后要妥善處理好升汞溶液)。

1.2.3有機物的處理

結(jié)合前人的研究結(jié)果以及前期的工作情況[1,3,12-15]，選用香蕉和椰乳作為有機物進行對比實驗，原因是香蕉和椰乳含有豐富的營養(yǎng)和生理活性物質(zhì)，廣泛地應用于植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和離體再生研究[12-16]。

香蕉的處理，稱500 g去皮的香蕉，切成0.5 cm3左右的細塊，放入500 mL的水中用小火慢煮，待細塊變?yōu)橹纯?；椰乳為市購椰子汁液?/p>

1.2.4培養(yǎng)基的配置

種子萌發(fā)的培養(yǎng)基：

1) MS；

2) MS+100 mL/L香蕉汁；

3) MS+100 mL/L椰乳；

4) MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L；

5) MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L香蕉汁；

6) MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L椰乳。

原球莖增殖的培養(yǎng)基：

1) 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg；

2) 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L香蕉汁；

3) 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L椰乳；

4) 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L香蕉汁+0.2 g/L活性炭；

5) 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L椰乳+0.2 g/L活性炭。

生根的培養(yǎng)基：

1) 1/2 MS+NAA 1.0 mg/L；

2) 1/2 MS+IBA 1.0 mg/L；

3) 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L；

4) 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+1.0 g/L活性炭。

種子和原球莖在光照和黑暗均勻(光照12 h/d，黑暗12 h/d)的條件下培養(yǎng)4周后，用放大鏡觀察，以種子膨大形成白色原球莖為發(fā)芽標準[28]，原球莖以生根和萌發(fā)幼芽為發(fā)芽標準進行萌發(fā)率統(tǒng)計。待原球莖轉(zhuǎn)綠出芽后，將原球莖轉(zhuǎn)入育苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待小苗出現(xiàn)2片葉后，轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在培養(yǎng)期間不斷觀察和記錄，待3～4個月后出瓶栽培。

表1 不同基質(zhì)對種子萌發(fā)率的影響

實驗組號培養(yǎng)基種子萌發(fā)率(%)培養(yǎng)4周培養(yǎng)6周培養(yǎng)8周1MS0072MS+100mL/L香蕉汁27133MS+100mL/L椰乳510204MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L02105MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+100mL/L香蕉汁817306MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+100mL/L椰乳122158

表2 原球莖增值培養(yǎng)

實驗組號培養(yǎng)基分化情況增殖情況增殖倍數(shù)植株生長11/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg———21/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+100mL/L香蕉汁轉(zhuǎn)綠成苗1.3生長慢31/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+100mL/L椰乳轉(zhuǎn)綠成苗3.5生長健壯,葉濃綠,生長快41/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+100mL/L香蕉汁+0.2g/L活性炭轉(zhuǎn)綠成苗1.8生長健壯,長勢慢51/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+100mL/L椰乳+0.2g/L活性炭轉(zhuǎn)綠成苗2.0長勢一般

表3 不同的激素及濃度對白花兜蘭生根的影響

實驗組號基質(zhì)培養(yǎng)時間(d)生根率(%)根的條數(shù)(條)11/2MS+NAA1.0mg/L———21/2MS+IBA1.0mg/L———31/2MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L53322～341/2MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+1.0g/L 活性炭35654～5

1.2.5煉苗、移栽

把需要移栽的試管苗先放在培養(yǎng)室外3 d后打開試管蓋，再在培養(yǎng)室外放5 d，然后移栽到配好的土壤基質(zhì)中，分別測定其對白花兜蘭移栽苗成活率的影響。試管生根苗移入栽培基質(zhì)后，其相對濕度保持在85%以上，可選用霧狀噴水的方式，無需設置保溫保濕的小環(huán)境，培養(yǎng)1周后再噴施營養(yǎng)液。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)對白花兜蘭種子萌發(fā)的影響

為了探究不同有機物對白花兜蘭種子萌發(fā)的影響，本試驗設計了6組培養(yǎng)基(表1)。由表1可見，第6組培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L椰乳)種子的發(fā)芽率最高，培養(yǎng)8周的發(fā)芽率為58%；其次是第5組培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L香蕉汁)種子的發(fā)芽率。發(fā)芽率最低的是第1組培養(yǎng)基(MS)，培養(yǎng)8周后的發(fā)芽率為7%?？梢娞砑舆m量的生長元素和有機物質(zhì)有利于促進白花兜蘭種子萌發(fā)。結(jié)果表明，適宜白花兜蘭種子無菌萌發(fā)最佳的培養(yǎng)配方組合為：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L椰乳。

2.2 不同培養(yǎng)基對白花兜蘭原球莖的增殖培養(yǎng)

為了解不同培養(yǎng)基對白花兜蘭原球莖增殖培養(yǎng)的影響，本實驗設計了5組培養(yǎng)基來探究白花兜蘭原球莖在不同培養(yǎng)基中的增殖發(fā)芽率。如表2所示，第3組培養(yǎng)基(1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L椰乳)原球莖增殖最快，增值倍數(shù)為3.5；其次是第5組培養(yǎng)基(1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L椰乳+0.2 g/L活性炭)，增值倍數(shù)為2.0。第1組培養(yǎng)基原球莖沒有分化，可見添加適量的有機物質(zhì)能促進白花兜蘭原球莖的分化。最佳增殖培養(yǎng)組合為：1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L椰乳。

2.3 不同培養(yǎng)基對生根培養(yǎng)的影響

為了探究不同培養(yǎng)基對白花兜蘭生根培養(yǎng)的影響，本實驗設計了4組培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基分別培養(yǎng)100株無根苗。如表3所示，第1組和第2組培養(yǎng)基在60 d內(nèi)均無生根，第3組培養(yǎng)基白花兜蘭培養(yǎng)53 d時開始生根，生根率為32%，生根條數(shù)平均為2～3條。第4組培養(yǎng)基培養(yǎng)的白花兜蘭在35 d時開始生根，生根率為65%，平均生根數(shù)為4～5條。表明白花兜蘭最佳生根培養(yǎng)組合為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+1.0 g/L活性炭。

2.4 煉苗時間與移栽基質(zhì)對白花兜蘭移栽苗成活率的影響

移栽前將生根瓶苗放入實驗室中揭開封口膜煉苗。煉苗處理如表4，分別煉苗5、7 d和14 d，以不煉苗直接移栽為對照。結(jié)果表明，煉苗時間對緩苗期和移栽成活率有一定的影響。不煉苗處理的移栽成活率最低，移栽成活率為4%。以煉苗7 d的移栽成活率最高，為72%。

把煉好的健壯苗從培養(yǎng)基取出，洗凈培養(yǎng)基，用0.1%多菌靈溶液浸泡根部4 min，清水洗去藥液，自然風干2～4 h后栽入已滅菌的栽培基質(zhì)中。栽培基質(zhì)主要分為3組，1) 樹皮∶火山石∶腐殖土(1∶1∶1)、 2) 樹皮、 3) 樹皮∶蛭石(2∶1)，1個月后計數(shù)成活率(表5)，培養(yǎng)基質(zhì)為 1) 的小苗長勢最好，成活率也最高，達76%；而栽培基質(zhì)為 3) 的小苗長勢最弱，成活率為41%。

實驗結(jié)果(表4、表5)顯示，煉苗的最佳時間為7 d。樹皮∶火山石∶腐殖土(1∶1∶1)的栽培基質(zhì)最適合白花兜蘭的生長。

表4 移栽苗的成活率

煉苗天數(shù)(d)成活率(%)生長狀況04根基本腐爛,緩苗時間長,長勢弱56根部分腐爛,植株黃,長勢弱772根不腐爛,根抓土性強,苗健壯,色綠,長勢好1464根不腐爛,抓土性一般,苗健壯,色綠

表5 移栽基質(zhì)對移栽苗成活率的影響

栽培基質(zhì)成活率(%)生長情況樹皮56根抓土性弱,苗長勢一般樹皮∶蛭石(2∶1)41根不抓土,緩苗時間長,長勢弱樹皮∶火山石∶腐殖土(1∶1∶1)76根抓土性強,苗健壯,色綠

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明，誘導白花兜蘭種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)組合為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L椰乳；原球莖的誘導和增殖最佳的培養(yǎng)基配比為1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L；有機添加物椰乳對白花兜蘭種子的萌發(fā)和原球莖的誘導與分化有較好的促進作用。1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+1.0 g/L 活性炭對白花兜蘭的根誘導效果最為理想；煉苗最佳時間為7 d，栽培基質(zhì)為樹皮∶火山石∶腐殖土(1∶1∶1)的移栽成活率達76%。

3.2 討 論

兜蘭是蘭科植物中極具開發(fā)價值的重點保護類群之一[12-16]，也是萌發(fā)較困難的種類之一[12]。本實驗以成熟未開裂的種子和健康茁壯成長的原球莖為外植體，以MS和1/2 MS為基礎培養(yǎng)基，添加不同激素配比[26]、不同的有機物、不同配比的活性炭等變量因素，研究其對白花兜蘭的種子萌發(fā)，原球莖芽的增殖、分化和生根誘導的影響，從中篩選出各個培養(yǎng)階段的最佳培養(yǎng)基配方。在成苗后對其進行煉苗，選出最佳的移栽基質(zhì)[27]，使白花兜蘭能在無菌狀態(tài)下播種和離體快速繁殖。

3.2.1影響白花兜蘭種子無菌萌發(fā)的因素

培養(yǎng)基中鹽分的組成和濃度是影響兜蘭種子萌發(fā)的重要因素[24-25]，且培養(yǎng)基中添加適當?shù)挠袡C物(如椰乳、香蕉和馬鈴薯)和活性炭均有利于蘭科植物種子的萌發(fā)和生長[15]。實驗顯示，加入適量(10%)的椰乳對兜蘭的種子萌發(fā)有促進作用，結(jié)果與前人的實驗結(jié)果相符[15-16]。白花兜蘭種子發(fā)芽后在MS的培養(yǎng)基內(nèi)生長較好，與其他本屬物種有很大的差異[12-16]?？傊?，影響種子發(fā)芽率的主要因素是激素的配比和有機物質(zhì)的種類，除此之外，種子發(fā)芽率還與種子本身的基質(zhì)有關，因此在選取實驗種子時，要注意種子的成熟度以及狀態(tài)、無菌操作等因素。

3.2.2有機物與白花兜蘭原球莖分化增殖

通過對比白花兜蘭原球莖在不同的培養(yǎng)基下分化和增殖的情況(表2)，發(fā)現(xiàn)原球莖在添加椰乳的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)綠成苗較快，且生長健壯，葉濃綠，生長快；培養(yǎng)基中適當添加有機物椰乳可提高原球莖的分化與增殖能力，與王蓮輝等[14]的研究結(jié)果一致；主要原因在于有機物中含有豐富的營養(yǎng)和生理活性物質(zhì)[16]，而椰乳中含的營養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì)的配比與白花兜蘭原球莖分化增殖所需的配比一致，因此加快了其生長速度，能夠達到短期快速增殖的效果。

3.2.3活性炭與白花兜蘭的生根

活性炭是組織培養(yǎng)工作中常用的物質(zhì)之一，它具有大量的小孔，所以具有巨大的表面積，吸附能力強[19]?；钚蕴吭诮M培培養(yǎng)中對苗的促進作用最早是1974年Anagnostakis在對煙草的研究中發(fā)現(xiàn)[18]。后來活性炭的其他作用陸續(xù)被報道，如能促進試管苗出芽，提高苗質(zhì)量；能提高花粉愈傷組織的誘導率，促進愈傷組織的生長和胚狀體的形成，顯著提高成苗率[20-21]；能吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)，還能模擬黑暗環(huán)境，促進試管苗的生根[20-21]等。本研究結(jié)果表明，活性炭對白花兜蘭的生根具有良好的促進作用，在培養(yǎng)基中加入活性炭，苗生長快，且挺拔健壯，與劉燕等[19]的研究結(jié)論一致。