潘云峰, 張楷正, 伍文馳, 李瓊, 宿友志

(四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院， 四川自貢643000)

引言

青稞屬禾本科大麥屬，是青藏高原最具特色的農(nóng)作物，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和一定的保健效果。每100 g青稞產(chǎn)熱量高達(dá)357 千卡，富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、淀粉，鈣、磷、鐵等微量元素含量也較高，并含有多種氨基酸和膳食纖維[1]。青稞被廣泛用來(lái)釀制青稞酒、咂酒[2]、啤酒以及青稞餅干[3]。

綠豆含有淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維、β-胡蘿卜素、維生素E、鈣、鉀、鎂、鐵、鋅、硒等營(yíng)養(yǎng)元素，還含有低聚糖、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)化合物和豆固醇等功能成分[4]，具有較高的營(yíng)養(yǎng)與保健價(jià)值。氧化過(guò)程被視為人體中許多慢性疾病(如癌癥、心血管疾病、動(dòng)脈硬化和糖尿病)的最初發(fā)展步驟之一[5]，而黃酮類(lèi)化合物具有較好的抗氧化及抗腫瘤功效[6-7]。研究還表明綠豆中的黃酮類(lèi)物質(zhì)具有緩解熱應(yīng)激的作用[8]，因而可以起到解暑的功效。

格瓦斯原產(chǎn)于俄國(guó)。傳統(tǒng)格瓦斯是以面包或麥芽為原料，經(jīng)自然發(fā)酵后產(chǎn)生的一種低酒度(小于1%)飲料[9]，具有風(fēng)味甘美、口感醇香微甜等特點(diǎn)，此外還具有健脾、降血壓、開(kāi)胃、消除疲勞等作用[10]。目前市場(chǎng)上已經(jīng)形成多種格瓦斯的工業(yè)化生產(chǎn)，其基本方法都是以小麥芽汁或面包浸提液為原料，經(jīng)添加乳酸菌或酵母菌發(fā)酵而成[11]。

為了豐富格瓦斯的品種和加強(qiáng)其保健功效，本文以青稞、綠豆為原料，干燥粉碎后，接種酵母菌和乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件，得到新型的青稞-綠豆格瓦斯(HM-K)飲料。有研究發(fā)現(xiàn)青稞酒含有促進(jìn)人體健康的有益功效物質(zhì)[12]，而本文制作的青稞-綠豆格瓦斯與其一樣都以青稞等谷物為原料經(jīng)發(fā)酵而成，由此推測(cè)HM-K可能也具有一定的抗氧化功效。本文測(cè)定了青稞-綠豆格瓦斯的總抗氧化力、還原力以及兩種自由基的清除能力，并檢測(cè)了其總黃酮、總酚類(lèi)物質(zhì)的含量，由此初步探究其保健作用，并為進(jìn)一步優(yōu)化其生產(chǎn)發(fā)酵工藝、研究其對(duì)人體的抗氧化及防暑解暑功效打下一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：青稞，產(chǎn)于四川省甘孜州瀘定縣；綠豆，購(gòu)于自貢沃爾瑪超市。

發(fā)酵菌劑：啤酒酵母、生香酵母和葡萄酒酵母，均購(gòu)于安琪酵母有限公司；保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌，均購(gòu)于北京川秀貿(mào)易有限公司。

青稞格瓦斯(HB-K)：實(shí)驗(yàn)室自制，與青稞綠豆格瓦斯(HM-K)的制作工藝相同，兩者只是在原料上有所區(qū)別，前者僅以青稞為原料，后者除了青稞外還有綠豆。將兩者進(jìn)行對(duì)比來(lái)探究發(fā)酵原料對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

市售格瓦斯樣品：WH-K和QL-K，均購(gòu)于自貢沃爾瑪超市。WH-K的主要原料為：水、果葡糖漿、白砂糖、濃縮麥芽汁、乳酸菌和其他食品添加劑；QL-K的主要原料為：水、面包提取液、乳酸菌、酵母菌、白砂糖和啤酒花。

試劑：沒(méi)食子酸、抗壞血酸、1,10-菲啰啉、三氯化鐵、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、福林-酚試劑、丁基羥基茴香醚、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酚酞、氫氧化鈉和30%過(guò)氧化氫，均產(chǎn)自成都科龍化工有限公司；DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；總抗氧化能力測(cè)定試劑盒，南京建成生物有限公司；α-淀粉酶和糖化酶，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；生化培養(yǎng)箱：SHP-250(E) ，上海培因?qū)嶒?yàn)室儀器有限公司；離心機(jī)：RJ-TGL-1850，無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司；粉碎機(jī)：FW-80，天津泰斯特儀器有限公司；電子天平：FA1004，常州市衡正電子儀器有限公司；手持酒精計(jì)：HYJJ5，北京華運(yùn)安特科技有限責(zé)任公司；pH測(cè)定儀：PHSJ-3F，上海精密科學(xué)儀器有限公司；手持糖度計(jì)：WZ101，海南博漢森科技開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1青稞-綠豆格瓦斯(HM-K)的制作工藝

HM-K的工藝流程如圖1 所示。

圖1 青稞-綠豆格瓦斯(HM-K)的制作工藝流程

HM-K的制作工藝要點(diǎn)：將青稞放入干燥箱中于60 ℃下干燥8 h，綠豆150 ℃烘焙15 min，兩者粉碎后混合，加水，100 ℃煮沸10 min進(jìn)行糊化，冷卻至55 ℃～60 ℃，加入α-淀粉酶，58 ℃液化1 h，加入糖化酶，60 ℃糖化6 h，過(guò)濾，濾液經(jīng)100 ℃煮沸10 min進(jìn)行滅酶，冷卻，接種等量的活化乳酸菌和酵母菌發(fā)酵劑，30 ℃發(fā)酵24 h，過(guò)濾，80 ℃滅菌10 min，放入2 ℃冰箱冷藏8 h，即得HM-K。

1.3.2HM-K發(fā)酵工藝的優(yōu)化

(1)發(fā)酵菌種的選擇

設(shè)雙岐乳桿菌為A，保加利亞乳桿菌為B，啤酒酵母為C，生香酵母為D，葡萄酒酵母為E，比較A+C(AC)、A+D(AD)、A+E(AE)、B+C(BC)、B+D(BD)、B+E(BE)等組合發(fā)酵下，格瓦斯的酒精度、酸度、還原糖和感官評(píng)分，由此選擇最優(yōu)的菌種組合。其他條件為：乳酸菌和酵母菌總接種量為0.2%(兩者各為0.1%)，發(fā)酵時(shí)間為24 h，發(fā)酵溫度為30 ℃。

(2)同步發(fā)酵法發(fā)與異步發(fā)酵法的比較

其他發(fā)酵條件相同的情況下，分別采用同步發(fā)酵法(酵母菌和乳酸菌同時(shí)加入)和異步發(fā)酵法(酵母菌和乳酸菌分兩步加入)，比較兩種發(fā)酵產(chǎn)品的理化指標(biāo)和感官品指標(biāo)，由此確定發(fā)酵方法。

(3)單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定原料配比(青稞∶綠豆)、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、菌劑添加量對(duì)格瓦斯質(zhì)量的影響，在此基礎(chǔ)上，采用設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝。

1.3.3產(chǎn)品理化和感官指標(biāo)檢測(cè)

還原糖：滴定法測(cè)定；pH值：pH計(jì)測(cè)定；糖度：手持糖度計(jì)測(cè)定；酸度：NaOH滴定法測(cè)定；酒精度：酒精計(jì)測(cè)定。

感官評(píng)定：參照新疆維吾爾自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB65/T2828-2008(發(fā)酵風(fēng)味飲料-格瓦斯)，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了一定完善，見(jiàn)表1。從青稞-綠豆格瓦斯的滋味、氣味、外觀、典型性四個(gè)指標(biāo)評(píng)定其品質(zhì)，滿(mǎn)分20分，由10位具有一定專(zhuān)業(yè)知識(shí)的人員來(lái)進(jìn)行評(píng)定。

表1 青稞綠豆格瓦斯感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.4抗氧化活性研究

(1)DPPH自由基清除能力測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了一定優(yōu)化，具體為：取5 mL不同濃度樣液(分別含原液0.1 mL、0.2 mL和0.3 mL)，加入5 mL DPPH-乙醇溶液(0.1 mmol/L)，室溫下避光反應(yīng)30 min，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為525 nm處測(cè)其光度值A(chǔ)1。另用5 mL乙醇(95%)代替5 mL樣液作為空白對(duì)照，用上述方法測(cè)得空白對(duì)照的光度值A(chǔ)0。檢測(cè)時(shí)，用95%乙醇調(diào)零。樣液吸光度小，則代表其清除DPPH能力強(qiáng)。DPPH自由基清除能力的計(jì)算式為：

(1)

(2)羥基自由基(·OH)清除能力測(cè)定

羥基自由基(·OH)清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了一定優(yōu)化，具體為：吸取1 mL1,10-菲啰啉無(wú)水乙醇溶液(5 mmol/L)于比色管中，加入2 mL的磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=7.4)，分別加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL樣液，充分混勻，加入1 mLFeSO4溶液(5 mmol/L)和1 mL過(guò)氧化氫(0.1%)，37 ℃恒溫水浴保溫1 h，用蒸餾水定容至10 mL，在536 nm處測(cè)得吸光度A2。另用1 mL蒸餾水代替1 mL樣液，得到損傷管，在536 nm處測(cè)得吸光度A3；再用2mL蒸餾水代替1 mL樣液和1 mL過(guò)氧化氫，得到未損傷管，在536 nm處測(cè)得吸光度A4。羥基自由基(·OH)清除能力的計(jì)算式為：

(2)

(3)還原能力的測(cè)定

還原能力的測(cè)定參照以文獻(xiàn)[15]，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了一定優(yōu)化，具體為：在1 mL不同濃度樣品(分別含原液0.1 mL、0.2 mL和0.3 mL)中加入2.5 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH=6.8)和2.5 mL鐵氰化鉀溶液(1 g/100 mL)，50 ℃下反應(yīng)20 min后，加入2.5 mL三氯乙酸(100 g/L)，3000 r/min下離心10 min ，取上清液3 mL，加3 mL去離子水和0.6 mL氯化鐵(1 g/L)，在700 nm處測(cè)其吸光度A6。另以1 mL純水代替1 mL樣液，用上述同樣方法測(cè)吸光度A5作空白對(duì)照。以BHA溶液(0.5 g/L)和抗壞血酸溶液(0.2 mmol/L)作陽(yáng)性對(duì)照。樣液的吸光度越大，代表其還原能力越好。

(4)總抗氧化力的測(cè)定

總抗氧化力用南京建成生物工程研究所的T-AOC(總抗氧化力)試劑盒來(lái)進(jìn)行測(cè)定。該試劑盒可穩(wěn)定且快速地測(cè)量樣品的自由基清除能力。37 ℃時(shí)，每毫升樣品液每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01作為一個(gè)抗氧化能力單位(U)。以BHA溶液(0.5 g/L)和抗壞血酸溶液(0.2 mmol/L)作陽(yáng)性對(duì)照。樣液的OD值高，代表其總抗氧能力強(qiáng)。

1.3.5總酚和總黃酮的測(cè)定

總酚的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了一定優(yōu)化，具體為：將1 mL樣品液用45 mL蒸餾水稀釋?zhuān)尤? mL福林-酚試劑，充分混合，3 min后加入3 mL Na2CO3(20g/L)，30 ℃溫育1.5 h并間歇震蕩，在760 nm處測(cè)其吸光度。樣品中總酚的計(jì)算式為：

(3)

總黃酮含量的測(cè)定的方法為：將1 mL離心后的樣品上清液置于25 mL比色管中，加入0.3 mL NaNO2溶液(5%)，搖勻，放置7 min，加入0.3 mL Al(NO3)3溶液(10%)，搖勻，放置7 min，加入4 mL NaOH溶液(4%)，并用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，在510 nm處測(cè)其吸光值。樣品中總黃酮的計(jì)算式為：

(4)

1.3.6數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA 及 Duncan 分析，P< 0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 HM-K發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.1.1發(fā)酵菌種的選擇

不同發(fā)酵菌種組合下格瓦斯感官評(píng)分如圖2 所示。

注：(1)A為雙岐乳桿菌，B為保加利亞乳桿菌，C為面包酵母，D為啤酒酵母，E為葡萄酒酵母。(2)誤差棒上的小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(p<0.05)，相同則差異不顯著。

圖2 不同發(fā)酵菌種組合的HM-K感官評(píng)分

從圖2 可知，菌種組合BD(保加利亞乳桿菌與生香酵母組合)發(fā)酵所得HM-K的感官評(píng)分最高，與其他五種菌種組合之間具有顯著性差異(p<0.05)，因此選擇保加利亞乳桿菌和生香酵母作為HM-K的混合發(fā)酵菌種。

2.1.2同步法、異步法發(fā)酵工藝的確定

同步發(fā)酵法與異步發(fā)酵法對(duì)HM-K品質(zhì)的影響見(jiàn)表2。

表2 同步發(fā)酵法與異步發(fā)酵法對(duì)HM-K品質(zhì)的影響

從表2可知，兩種發(fā)酵法所得產(chǎn)品的感官評(píng)分相差不大；此外，同步發(fā)酵法制備的HM-K的酒精度高于異步發(fā)酵法的，還原糖含量的情況則相反，這是因?yàn)橥椒ㄖ薪湍妇尤霑r(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)酵體系中的還原糖被利用得更徹底，產(chǎn)生的酒精更多；再者，異步發(fā)酵法制備的HM-K的酸度略高于同步發(fā)酵法的，這是因?yàn)楫惒桨l(fā)酵法中先接入乳酸菌，其生長(zhǎng)的時(shí)間較同步法中更長(zhǎng)，因此產(chǎn)生更多的乳酸使得酸度增加。綜上所述，并且考慮到同步發(fā)酵法操作更加簡(jiǎn)單，而異步法的分步添加菌種會(huì)增大雜菌污染幾率，因此選擇同步發(fā)酵法進(jìn)行后續(xù)的研究。

2.1.3單因素實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，分別研究青稞與綠豆的比例(5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1)、發(fā)酵溫度(28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃和36 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(6 h、12 h、18 h、24 h和30 h)、菌劑添加量(0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%)對(duì)HM-K品質(zhì)的影響。單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)HM-K感官評(píng)分的影響如圖3 所示，誤差棒上的小寫(xiě)字母不同代表差異顯著(p<0.05)，相同則差異不顯著。

圖3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖3 (a)～3(d) 可知，單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明適宜的發(fā)酵條件是：青稞與綠豆的比例7∶3、發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度30 ℃、菌劑添加量0.2%。

2.1.4正交試驗(yàn)及驗(yàn)證

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇原料比、發(fā)酵時(shí)間、菌劑添加量和發(fā)酵溫度4種因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行進(jìn)一步地優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表3，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 HM-K發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)因素與水平

注：A為原料比(青稞∶綠豆)，B為發(fā)酵時(shí)間，C為菌種添加量，D為發(fā)酵溫度。

從表4可知，4個(gè)因素對(duì)HM-K感官評(píng)分的影響按大小排列依次為A(原料比)>D(發(fā)酵溫度)>B(發(fā)酵時(shí)間)=C(菌劑添加量)，最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B2C3D2，即青稞與綠豆比例為7∶3，發(fā)酵時(shí)間為24 h，菌劑添加量為0.25%，發(fā)酵溫度為30 ℃。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

注：A為原料比(青稞∶綠豆)，B為發(fā)酵時(shí)間，C為菌種添加量，D為發(fā)酵溫度。

做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，對(duì)最優(yōu)發(fā)酵條件A2B2C3D2進(jìn)行驗(yàn)證，所得青稞-綠豆格瓦斯(HM-K)呈棕黃色，明亮有光澤，酸味適宜，酯香味和醇香味突出，有青稞和綠豆特有的香味，無(wú)雜質(zhì)沉淀，搖動(dòng)有較多氣泡，酸甜適宜，口感純正，有較強(qiáng)殺口性，感官評(píng)分為16.8±1.3a，高于正交試驗(yàn)中的最高感官評(píng)分15.1±2.1b(表4)，說(shuō)明正交試驗(yàn)的結(jié)果是正確的。

2.2 抗氧化活性研究

2.2.1DPPH自由基清除力

DPPH是一種很穩(wěn)定的自由基，可以捕獲(清除)其他自由基[17]。DPPH自由基的吸收波長(zhǎng)在520 nm左右，在本實(shí)驗(yàn)中，最大吸收波長(zhǎng)確定為525 nm，用0.5 g/L的BHA溶液和0.17 g/L的沒(méi)食子酸(Gallic Aci)作陽(yáng)性對(duì)照。樣液吸光度小，則代表其DPPH清除能力強(qiáng)。

四種格瓦斯與陽(yáng)性對(duì)照BHA和沒(méi)食子酸的DPPH自由基清除率如圖4 所示，清除率越高表示DPPH清除活性越強(qiáng)；100 μL、200 μL和300 μL代表樣品液的量；誤差棒上的小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(p<0.05)，相同則差異不顯著。

圖4 四種格瓦斯、BHA和沒(méi)食子酸對(duì)DPPH自由基的清除率

從圖4 可知，HM-K與HB-K都具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，明顯高于QL-K和WH-K，其中HM-K的DPPH自由基清除能力在四中格瓦斯中是最強(qiáng)的且高于陽(yáng)性對(duì)照BHA，不過(guò)低于陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)食子酸；所有樣品的DPPH自由基清除率都隨樣品量的增加而增加，在樣品含量為300 μl時(shí)，HB-K、HM-K、QL-K、WH-K、BHA和Gallic Acid的DPPH自由基清除率分別為：66.51%、76.55%、13.12%、14.32%、58.60%和91.12%。HM-K的DPPH自由基清除率高于HB-K，原因可能是其原料中加入了30%的綠豆，有研究表明綠豆皮中富含黃酮類(lèi)物質(zhì)[18]，而黃酮類(lèi)物質(zhì)具有良好的抗氧化活性[13]，由此推測(cè)是綠豆導(dǎo)致了HB-K與HM-K間的DPPH自由基清除力差異。

2.2.2羥基自由基(·OH-)的清除力

羥基自由基是一種氧化活性極強(qiáng)的自由基，在人體內(nèi)會(huì)對(duì)器官造成傷害，它具有最高的單電子還原電位(2310 mV)，可以與脂質(zhì)、多肽、蛋白質(zhì)和DNA反應(yīng)。檢測(cè)樣品對(duì)羥基自由基的清除活性可作為衡量其抗氧化活性的方法[19]。用0.5 g/L的BHA溶液和0.2 mmol/L的抗壞血酸(Ascorbic Acid)作陽(yáng)性對(duì)照。

四種格瓦斯和BHA、Ascorbic acid的羥基自由基清除率如圖5 所示，清除率越高表示樣品的清除活性越強(qiáng)，誤差棒上的小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(p<0.05)，相同則差異不顯著。

圖5 四種格瓦斯和BHA、Ascorbic acid的羥基自由基清除率

從圖5 可知，四種格瓦斯的羥基自由基清除率都不高，明顯低于陽(yáng)性對(duì)照BHA和Gallic Acid(p<0.05)；樣品含量為300 μL時(shí)，HM-K、HB-K、WH-K和QL-K的清除率分別為16.14%、15.14%、6.33%和7.83%，HM-K的值最高，其次是HB-K，兩者明顯高于WH-K和QL-K(p<0.05)；對(duì)同一樣品來(lái)說(shuō)，隨其添加量的增加，清除率雖有所增加但變化不明顯，如HM-K在樣品量為100 μL、200 μL、300 μL時(shí)，清除率分別為12.11%、14.21%和16.14%。

2.2.3還原能力

抗氧化劑(還原劑)是通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基，其還原能力越強(qiáng)則抗氧化性越強(qiáng)。在低pH溶液中Fe3+被抗氧化劑還原成Fe2+，使反應(yīng)液變成深藍(lán)色，在700 nm處有最大吸收，可通過(guò)吸光度大小來(lái)判定抗氧化劑還原能力，吸光度越大，則還原能力越強(qiáng)。用0.5 g/L的BHA溶液和0.2 mmol/L的抗壞血酸(Ascorbic acid)作陽(yáng)性對(duì)照。

四種格瓦斯和BHA、Ascorbic Acid的還原力(以吸光度表示)如圖6 所示，誤差棒上的小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(p<0.05)，相同則差異不顯著。

圖6 四種格瓦斯和BHA、Ascorbic Acid的還原力

從圖6 可知，四種格瓦斯的還原力隨其樣品量的增加而顯著增加(p<0.05)；HM-K的還原能力均高于其他三種格瓦斯，特別是明顯高于WH-K與QL-K(p<0.05)，但低于陽(yáng)性對(duì)照BHA和Ascorbic acid(p<0.05)。

2.2.4總抗氧化力(T-AOC)

用總抗氧化試劑盒來(lái)測(cè)定總抗氧化力，測(cè)得的值越大則表示總抗氧化力越強(qiáng)。四種格瓦斯和陽(yáng)性對(duì)照BHA與抗壞血酸(Ascorbic Acid)的總抗氧化力如圖7 所示，誤差棒上的小寫(xiě)字母不同表示樣品間差異顯著性(p<0.05)，相同則表示差異不顯著。

圖7 四種格瓦斯、BHA和Ascorbic Acid的總抗氧化力

從圖7 可知，HB-K、HM-K、WH-K、QL-K、BHA和Ascorbic Acid的總抗氧化力分別為16.21 U/mL、19.14 U/mL、2.91 U/mL、3.82 U/mL、16.47 U/mL、10.61 U/mL，HM-K和HB-K總抗氧化力較高，其中HM-K的總抗氧化力明顯大于其他格瓦斯樣品(p<0.05)，且比陽(yáng)性對(duì)照BHA和Ascorbic Acid的總抗氧化力高(p<0.05)。WH-K與QL-K的總抗氧化力相近但明顯低于HB-K與HM-K，推測(cè)這主要是由于原料與發(fā)酵工藝的差異所引起的，而HB-K、HM-K的總抗氧化力差異可能也是主要源于原料的差異，由此說(shuō)明原料是影響格瓦斯抗氧化活性的主要原因。

2.3 總黃酮和總酚含量檢測(cè)

四種格瓦斯的總黃酮和總酚含量見(jiàn)表5，小寫(xiě)字母不同表示樣品間差異顯著(p<0.05)，相同則差異不顯著。

表5 四種格瓦斯的總黃酮和總酚含量

從表5可知，HM-K的總黃酮含量最高，其次是HB-K，兩者明顯高于WH-K和QL-KD(p<0.05)，HM-K與HB-K的總黃酮含量間也存在顯著差異(p<0.05)；而HM-K與HB-K的總酚含量差距不大，但都明顯高于其他兩種市售格瓦斯(p<0.05)。可能是原料和發(fā)酵工藝的差異造成了上述差異。

有研究表明，啤酒中的酚類(lèi)化合物主要來(lái)源于釀造原料大麥麥芽和啤酒花[20]，而HM-K和HB-K的制備工藝與啤酒類(lèi)似，由此推斷其酚類(lèi)和黃酮類(lèi)也是主要源于原料青稞與綠豆。黃酮和酚類(lèi)都具有良好抗氧化功效，據(jù)此推測(cè)格瓦斯樣品間的DPPH自由基清除力、羥基自由基清除率、還原力和總抗氧化力所表現(xiàn)出的差異，是由其總黃酮和總酚含量上的差異所引起的，而原料的差異是導(dǎo)致總黃酮和總酚含量差異的主因。

3 結(jié)論

為了豐富格瓦斯的品種和加強(qiáng)其保健功能，以青稞和綠豆為原料，通過(guò)發(fā)酵來(lái)制備新型的青稞-綠豆格瓦斯(HM-K)，設(shè)計(jì)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其抗氧化特性和抗氧化機(jī)理展開(kāi)研究，與其他三種格瓦斯品種進(jìn)行了對(duì)比。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

(1)HM-K的最佳發(fā)酵工藝是：選擇同步發(fā)酵法，以保加利亞乳桿菌與生香酵母為混合發(fā)酵劑，青稞與綠豆比例為7∶3，添加菌劑量為0.25%(兩種菌各為0.125%)，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為24 h，所得青稞綠豆格瓦斯產(chǎn)品呈棕黃色，明亮有光澤，酸味適宜，酯香和醇香味突出，有青稞和綠豆特有的香味，有較多氣泡，殺口性較強(qiáng)。

(2)HM-K與HB-K具有較高的DPPH自由基清除力、羥基自由基(·OH-)清除力、還原力和總抗氧化力，特別是HM-K皆明顯高于WH-K與QL-K(p<0.05)。

(3)HM-K的總黃酮含量最高(125.21 mg/L)，其次是HB-K(97.46 mg/L)，兩者明顯高于WH-K和QL-K(p<0.05)，HM-K與HB-K的總黃酮含量間也存在顯著差異(p<0.05)；而HM-K(137.46 mg/L)與HB-K(135.21 mg/L)的總酚含量差距不大，但都明顯高于WH-K和QL-K(p<0.05)。

四種格瓦斯樣品間的抗氧化特性差異可能是由其總黃酮和總酚含量的差異所引起的，而原料和發(fā)酵工藝的差異則可能是導(dǎo)致總黃酮和總酚含量差異的主因。本研究為新型格瓦斯飲料的發(fā)酵工藝、保健功效研究提供了一定的參考。