孫曉，田仁芳，董靖，賈寒冰，張亞鋒

近年來，人們健康意識(shí)不斷提升，對(duì)保健食品的需求也不斷增加[1]。為了提高產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭力，仍有人鋌而走險(xiǎn)將化學(xué)藥品加入保健食品中，使保健食品產(chǎn)生速效作用，在短期內(nèi)騙取群眾口碑，進(jìn)而增加銷量謀取巨額利潤[2]。其中，改善睡眠類保健食品需求量較大，臨床上應(yīng)用廣泛的安神類化學(xué)藥物成為了增強(qiáng)此類產(chǎn)品療效的優(yōu)先選擇[3-4]。人們?nèi)绻L期攝入這類化學(xué)藥物，容易產(chǎn)生藥物依賴性，因此對(duì)該類產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)迫在眉睫[5]。

目前保健食品中非法添加物的檢測(cè)方法有薄層色譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)等。其中薄層色譜法、紫外分光光度法操作簡便，所需時(shí)間短，但專屬性較弱[6]。高效液相色譜法具有靈敏度高、專屬性好、設(shè)備費(fèi)用適中的優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是對(duì)于具有相同色譜行為，相同紫外吸收的同母核修飾化合物不具備分離鑒定能力[7-8]。本研究采用目前最先進(jìn)科學(xué)的HPLC-MS/MS分析測(cè)試方法，于2016年7月開展研究，經(jīng)大量方法學(xué)考察，結(jié)果證明該方法靈敏度最高、專屬性最強(qiáng)。能較大程度避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，同時(shí)能做到微量甚至痕量的準(zhǔn)確分析，又能避免假陰性結(jié)果的產(chǎn)生[9]，可推廣應(yīng)用于改善睡眠類保健食品中的非法添加物的檢測(cè)監(jiān)管，進(jìn)而保障群眾用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent1200-6410B高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(檢測(cè)器三重四級(jí)桿QQQ，美國Agilent公司)；電子分析天平(德國Mettler-Toledo系列)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥青藤堿(批號(hào)：110774-200507)；佐匹克隆(批號(hào)：100870-200801)；文法拉辛(批號(hào)：100543-200401)；羅通定(批號(hào)：100452-200301)，以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購自中國藥品生物制品檢定院；氯苯那敏(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100047-200606)；褪黑素(Dr.Ehrenstorfer.GmbH，批號(hào)：41222)；扎來普隆(TRC，批號(hào)：4-ANR-96-1)。甲醇、冰醋酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙酸銨(Aladdin，色譜純)、乙腈(Merck，色譜純)；水(實(shí)驗(yàn)室自制，超純水)。樣品為本市轄區(qū)內(nèi)隨機(jī)抽樣所得，001號(hào)為夢(mèng)香源膠囊，002號(hào)為白色粉末，003號(hào)為安睡片。取陰性樣品，加入上述混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，充分混合均勻，作為模擬陽性樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件色譜柱為CAPCELLPAK C18MG Ⅲ C18(150 mm×2.0 mm，5 μm)。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.01 mol/L乙酸銨溶液(含0.1%乙酸)，梯度洗脫：0～6 min，20%A；6～6.5 min，20%～40%A；6.5～15 min，40%～45%A；15～30 min，45%A；30～31 min，45%～20%A；31～36 min，20%A。流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)器QQQ，離子源ESI+，霧化氣溫度300 ℃，霧化氣流速10 L/min，MRM掃描，MRM母離子/子離子信息見表1[10-11]。

表1 化合物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子信息

注：a為定量離子

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的配制分別精密稱取青藤堿、佐匹克隆、褪黑素、文法拉辛、氯苯那敏、羅通定、扎來普隆標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.00 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備溶液；用刻度移液管分別精密移取以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備溶液5 mL，置于50 mL容量瓶中，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液。

2.3 供試品溶液的制備取供試品5粒置于研缽中研磨均勻，精密稱取0.45 g，于50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，取出放冷至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，備用。吸取上清液適量稀釋500倍，0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。如果樣品未檢出非法添加物，建議再過濾一瓶未稀釋的供試品母液，以排除假陰性結(jié)果。

2.4 專屬性試驗(yàn)分別取陰性樣品樣品、模擬陽性樣品按“2.3”項(xiàng)下處理，取混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、陰性樣品、模擬陽性樣品按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果模擬陽性樣品在與混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各組分相同保留時(shí)間處，離子流圖一致。表明該方法可有效排除雜志干擾，專屬性良好。總離子流圖(TIC圖)見圖1。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配制精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液適量，依次用甲醇稀釋定容，制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果表明各組分線性關(guān)系良好，見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.6 精密度試驗(yàn)精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，分別計(jì)算7種組分的RSD(n=6)分別為1.37%，1.79%，1.01%，0.96%，1.51%，1.21%，0.86%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 檢出限試驗(yàn)將各組分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)逐級(jí)稀釋，計(jì)算信噪比S/N=3時(shí)各組分濃度，結(jié)果確定青藤堿、佐匹克隆、褪黑素、文法拉辛、氯苯那敏、羅通定、扎來普隆檢出限分別是1.78、2.17、1.76、1.70、1.90、2.19、1.58 ng/mL。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取模擬陽性樣品6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法同法處理，得到平行樣品6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算6份樣品中7種組分的RSD分別為1.74%、1.91%、1.12%、0.99%、1.49%、0.97%、0.89%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取模擬陽性樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定測(cè)定，記錄峰面積，分別計(jì)算7種組分的RSD(n=6)分別為1.23%、1.01%、1.69%、0.91%、1.51%、1.03%、1.08%，表明樣品12 h穩(wěn)定性良好；精密標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，分別在0、2、4、8、16、36 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定測(cè)定，記錄峰面積，分別計(jì)算7種組分的RSD(n=6)分別為1.49%、1.17%、1.39%、1.27%、1.55%、1.26%、1.73%，表明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)12 h穩(wěn)定性良好。

2.10 加標(biāo)回收試驗(yàn)精密稱取已知含量的樣品9份，分為三組，每組3份，分別向每份樣品加入混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液適量，制成高、中、低三梯度三平行的加標(biāo)回收樣品，按照“2.3”項(xiàng)下同法處理該9份樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各組分回收率，結(jié)果表明該方法回收率可靠、穩(wěn)定，見表3。

2.11 樣品測(cè)定稱取3批次保健食品樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各組分含量，結(jié)果2批次未檢出非法添加組分，1批次僅檢出褪黑素，見表4。

3 討論

本文所研究的檢測(cè)方法，采用了更為先進(jìn)、科學(xué)的HPLC-MS聯(lián)用法。相比于傳統(tǒng)的高效液相色譜法、薄層色譜法、理化鑒別等方法，能夠極大程度上避免假陽性和假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，靈敏度更高，定性/定量結(jié)果更準(zhǔn)確，分析速度更快。

注：1.青藤堿；2.佐匹克??；3.褪黑素；4.文法拉辛；5.氯苯那敏；6.羅通定；7.扎來普隆圖1 總離子流圖:A為混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；B為陰性樣品；C為模擬陽性樣品

組分樣品含量/(ng/mL)加標(biāo)量/(ng/mL)測(cè)得量/(ng/mL)梯度1梯度2梯度3梯度1梯度2梯度3平均回收率/%RSD/%青藤堿0.005.476.848.215.246.518.150.005.476.848.215.336.548.240.005.476.848.215.296.508.1797.21 2.10佐匹克隆0.005.877.288.745.657.168.500.005.877.288.745.637.078.440.005.877.288.745.767.218.4997.31 1.06褪黑素0.005.426.778.125.116.517.930.005.426.778.125.116.577.910.005.426.778.125.046.567.8995.99 1.79文法拉辛0.005.216.527.825.156.317.510.005.216.527.825.106.267.440.005.216.527.825.226.397.5597.27 1.63氯苯那敏0.005.857.318.775.897.248.620.005.857.318.775.847.278.560.005.857.318.775.837.258.6099.09 0.97羅通定0.006.728.4010.086.378.099.690.006.728.4010.086.398.109.610.006.728.4010.086.378.119.5695.59 0.79扎來普隆0.006.057.569.075.897.548.950.006.057.569.075.887.618.830.006.057.569.075.927.498.9598.51 1.21

表4 樣品測(cè)定結(jié)果/(g/kg)

將現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)2013002和編號(hào)2012004)中所囊括的7種安神類非法添加物質(zhì)[12-13]，由三種體系檢測(cè)改進(jìn)為單體系單針檢測(cè)，效率更高結(jié)果更準(zhǔn)確。相比于(編號(hào)BJS 201710)前處理過程，本研究方法增加了稀釋步驟，可有效預(yù)防解決質(zhì)譜檢測(cè)器的污染問題；其次本方法針對(duì)改善睡眠類保健食品違禁藥物添加問題，選擇了針對(duì)性更強(qiáng)的化學(xué)添加藥物進(jìn)行檢測(cè)，待測(cè)組分離子響應(yīng)更強(qiáng)，干擾更小。

綜上所述，本研究方法能夠有效地縮短檢測(cè)時(shí)間，節(jié)省實(shí)驗(yàn)人員、儀器、試劑等方面的成本，加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度，提高了監(jiān)管分析工作效率，具有很好的應(yīng)用價(jià)值及前景。