趙同偉 潘智敏 袁國(guó)榮 盧麗琴 谷建鐘 洪譽(yù)鵬 蘇 丹 周紅英 洪朝金 欽志泉#

1 浙江省人民醫(yī)院 浙江 杭州 310014

2 杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院 浙江 杭州 310014

3 浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310006

本研究利用人肺腺癌A549細(xì)胞（EGFR野生型）構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，驗(yàn)方“扶正祛積湯”聯(lián)合?？颂婺岣深A(yù)后，研究中西醫(yī)結(jié)合治療的協(xié)同抑瘤作用并探討對(duì)移植瘤Fas、Bax和CyclinD1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料：分述如下。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料：扶正祛積湯來(lái)自于潘智敏教授臨床經(jīng)驗(yàn)方；?？颂婺嶙再?gòu)自浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司（產(chǎn)品批號(hào)：20161207）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：20只BLAB/c裸鼠購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[（許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010］，均雄性，6～8周齡，重量16～24g。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑：Fas抗體（affinity Biosciences）、Bax抗體（affinityBiosciences）、CyclinD1抗體（Cell Signaling Technology）、WB相關(guān)試劑（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）、DAB顯色試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 扶正祛積湯組成及制備：全方由南沙參、北沙參、太子參、莪術(shù)、貓爪草、魚(yú)腥草等15味草藥組成。在浙江省立同德醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤研究所煎制和抽提，經(jīng)分裝滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 裸鼠移植瘤模型的建立及分組灌胃：每只裸鼠腋下接種1×106個(gè)細(xì)胞，接種后14天，皮下移植瘤形成。將成瘤的裸鼠隨機(jī)分為4組，每組5只，分籠飼養(yǎng)，按分組灌胃，分別為模型組（生理鹽水）、扶正祛積湯組（原液濃度50%）、?？颂婺峤M（50mg/Kg/d）、扶正祛積湯聯(lián)合?？颂婺峤M（兩藥劑量同單藥組），每組均灌胃200μl，1次/天，共21天，末次給藥24h脫頸處死裸鼠，取出移植瘤進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 腫瘤體積、抑瘤率和增效率的測(cè)定：灌胃前1天，灌胃第6、11、16和21天，測(cè)量移植瘤的最大長(zhǎng)徑（a）和橫徑（b），再根據(jù)公式[體積=1/2×ab2；抑瘤率=（C-T）/C×100%，C為模型組移植瘤的平均體積，T為處理組移植瘤的平均體積］計(jì)算出各組抑瘤率和聯(lián)合組增效率。聯(lián)合組扶正祛積湯增效率(%)Q=(聯(lián)合組抑瘤率+?？颂婺峤M抑瘤率)/(?？颂婺峤M抑瘤率+聯(lián)合組抑瘤率-埃克替尼組抑瘤率×聯(lián)合組抑瘤率)×100%；結(jié)果判定：Q＞1為增效，Q=1為相加，Q＜1為無(wú)效。

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)Fas、Bax的表達(dá)：免疫組化采用SP法，參照SP法常規(guī)步驟操作。結(jié)果判斷：Fas定位于細(xì)胞膜，Bax定位于胞漿，分別以胞膜、胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。采用雙盲法，觀察切片至少5個(gè)具有代表性的高倍視野，拍攝照片，使用Image-Pro Plus 6.0對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，得到每個(gè)樣本平均光密度值（MOD），計(jì)算每組標(biāo)本的平均MOD值，代表該組移植瘤該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western Blot法檢測(cè)CyclinD1的表達(dá)：取各樣本腫瘤組織，分別制成細(xì)胞勻漿，進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取細(xì)胞總蛋白。按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜。脫脂奶粉封閉，CyclinD1一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1h，ECL孵育3～5min。暗室中用X膠片感光、顯影、定影。采用GAPDH蛋白表達(dá)作為內(nèi)參照，采用Image J掃描軟件掃描WB條帶得到CyclinD1灰度值，該灰度值和GAPDH的灰度值的比值即為CyclinD1表達(dá)的相對(duì)值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 扶正祛積湯對(duì)?？颂婺嵋种品伟〢549細(xì)胞裸鼠移植瘤的影響：灌胃第21天埃克替尼組與扶正祛積湯組抑瘤率之和＜聯(lián)合組抑瘤率，聯(lián)合組增效率=111.11%，增效率＞1，說(shuō)明扶正祛積湯對(duì)?？颂婺嵊性鲂У淖饔?，扶正祛積湯聯(lián)合?？颂婺岷竽軈f(xié)同增效抑制移植瘤生長(zhǎng)。見(jiàn)表1。

表1 各組裸鼠移植瘤抑瘤率變化（%，n=20）

2.2 扶正祛積湯聯(lián)合埃克替尼對(duì)肺裸鼠移植瘤Fas、Bax表達(dá)的影響：各組裸鼠移植瘤指標(biāo)免疫組化MOD值見(jiàn)表2。Fas組化染色結(jié)果見(jiàn)圖1，蛋白定位細(xì)胞膜，在細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。聯(lián)合組瘤組織Fas蛋白的MOD明顯高于?？颂婺峤M、扶正祛積湯組和模型組（P＜0.05）。Bax組化染色結(jié)果見(jiàn)圖2，蛋白定位于細(xì)胞漿，在細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。聯(lián)合組瘤組織Bax蛋白的MOD要明顯高于?？颂婺峤M、扶正祛積湯組和模型組（均P＜0.05）。

表2 各組裸鼠移植瘤Fas和Bax蛋白MOD值（±s，n=20）

表2 各組裸鼠移植瘤Fas和Bax蛋白MOD值（±s，n=20）

注：與聯(lián)合組比較，*P＜0.05。

組別模型組?？颂婺峤M扶正祛積湯組聯(lián)合組Bax 264875.14±106540.22*355662.01±193885.64*338772.29±165312.96*45632.26±24039.97 Fas 29510.90± 8443.14*412833.80±136696.20*42273.35±23462.76*472656.87±149156.91

模型組 ?？颂婺峤M 扶正祛積湯組

圖1 各組裸鼠移植瘤組織Fas染色（SP法，200倍）

模型組 ?？颂婺峤M 扶正祛積湯組

圖2 各組裸鼠移植瘤組織Bax染色（SP法，200倍）

2.3 扶正祛積湯聯(lián)合?？颂婺釋?duì)肺移植瘤cyclinD1表達(dá)的影響：各組移植瘤組織cyclinD1蛋白表達(dá)見(jiàn)圖3。模型組、?？颂婺峤M、扶正祛積湯組和聯(lián)合組的CyclinD1蛋白表達(dá)相對(duì)值（CyclinD1/GAPHD）分別為0.39±0.10、0.30±0.093、0.32±0.13和 0.22±0.064。聯(lián)合組cyclin D1表達(dá)水平明顯低于?？颂婺峤M（P＜0.05）、扶正祛積湯組（P＜0.05）和模型組（P＜0.01）。

圖3 各組裸鼠移植瘤cyclinD1蛋白表達(dá)

3 討論

進(jìn)展期NSCLC多為氣陰兩虛，邪積多為痰、瘀、熱毒，扶正祛積湯治療以益氣養(yǎng)陰、化痰祛瘀為主，藥用南沙參、北沙參、太子參、麥冬、天冬、鮮石斛益氣養(yǎng)陰，制半夏、浙貝、米仁、萊菔子、莪術(shù)化痰祛瘀，貓爪草、黃芩、魚(yú)腥草、野蕎麥根清熱解毒，全方攻補(bǔ)兼施，祛邪不傷正，補(bǔ)虛不留邪。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合組增效率為111.11%，說(shuō)明扶正祛積湯聯(lián)合埃克替尼對(duì)肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑瘤效果明顯強(qiáng)于?？颂婺峤M。聯(lián)合組Fas的表達(dá)明顯高于?？颂婺峤M（P＜0.05），可以明顯抑制移植瘤的增殖，說(shuō)明扶正祛積湯可以進(jìn)一步提高埃克替尼引起的Fas的表達(dá)水平而增加抑瘤效果。聯(lián)合組瘤組織Bax表達(dá)水平要明顯高于埃克替尼組（P＜0.05），提示扶正祛積湯可以進(jìn)一步提高埃克替尼引起的Bax的表達(dá)水平，這可能和兩者協(xié)同抑制移植瘤的增殖有關(guān)。聯(lián)合組移植瘤組織cyclin D1的表達(dá)水平顯著低于?？颂婺峤M（P＜0.05），提示扶正祛積湯可以進(jìn)一步降低?？颂婺嵋鸬腸yclinD1的表達(dá)下降，協(xié)同?？颂婺嵋种颇[瘤細(xì)胞的分裂增殖。

綜上，扶正祛積湯可以提高?？颂婺釋?duì)肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用，扶正祛積湯的協(xié)同增效抑瘤機(jī)制可能和提高Fas、Bax表達(dá)水平和降低CyclinD1的表達(dá)水平有關(guān)。當(dāng)然，本研究還存在不足，例如未能深入研究扶正祛積湯聯(lián)合?？颂婺嵋种品伟┘?xì)胞增殖的信號(hào)通路機(jī)制，F(xiàn)as和Bax使用了免疫組化未使用半定量的Western blot等，未檢測(cè)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡等，這些均有待于進(jìn)一步研究和完善。