王 敏 張 珊 慕家盛 王媛媛 楊青男 黃澤旭 陳啟稚

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海市 200011，電子郵箱：minnwang@163.com)

急性心肌梗死是全球致死率極高的疾病之一[1]。伴隨著病變血管的開通，再灌注過程中產(chǎn)生的大量自由基、鈣超載等造成的心肌缺血再灌注損傷 (ischemia/reperfusion injury,IRI) 越來越常見[2]。早在1960年，Jennings等[3]即指出缺血再灌注其實(shí)是一把雙刃劍。冠狀動(dòng)脈再通對(duì)于挽救瀕危心肌、改善患者癥狀和預(yù)后的益處毋庸置疑，但如何預(yù)防和治療隨之而來的再灌注損傷已成為臨床迫切需要解決的難題。

蛋白酶激活受體2(protease-activated receptor 2,PAR2)是七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體的重要成員,表達(dá)于心血管系統(tǒng)多種類型細(xì)胞(如心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞)，與IRI引起的氧化應(yīng)激密切相關(guān)[4-6]。研究表明，PAR2激活可以減輕IRI后心肌氧化應(yīng)激損傷，減少心肌梗死面積，改善心肌功能失調(diào)，發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)[5]，但PAR2缺陷對(duì)IRI后心肌氧化應(yīng)激的影響尚不明確。因此，本研究構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧 (hypoxia/reoxygenation,H/R)模型，模擬在體心肌缺血再灌注，從氧化應(yīng)激的角度探討敲低PAR2基因?qū)RI后心肌的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 大鼠心肌細(xì)胞株H9c2購自上海市中科院細(xì)胞庫；針對(duì)大鼠心肌細(xì)胞株H9c2的PAR2小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)(正義鏈：5′-GCUGCUCGUCGUGCAUUAUTT-3′，反義鏈：5′-AUAAUGCACGACGAGCAGCTT-3′)及非特異性siRNA(正義鏈： 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)由上海吉瑪公司合成；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)由HyClone公司生產(chǎn)(批號(hào)：SH30022.01)，特級(jí)胎牛血清由Gibco公司生產(chǎn)(10100147C)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)由Dycent Biotech公司生產(chǎn)(批號(hào)：7647-14-5)，0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid,Trypsin-EDTA)由Gibco公司生產(chǎn)(批號(hào)：25200056)；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體3000由Life Technologies公司生產(chǎn)(批號(hào)：L3000015)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供(批號(hào)：A020-1、A001-3、A003-2)；AMV反轉(zhuǎn)錄酶由Promega公司生產(chǎn)(批號(hào)：A3500)，F(xiàn)astStart SYBR-Green/Rox試劑由Roche公司生產(chǎn)(批號(hào)：4913850001)。2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)熒光探針由碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)(批號(hào)：S0033)。

1.2 主要儀器 Heraeus 150型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱由Thermo公司生產(chǎn)，ABI-7500 Fast型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由Applied Biosystems公司生產(chǎn)，MIC-101型缺氧培養(yǎng)小室由Billups-Rothenberg公司生產(chǎn)，Synergy H1全功能酶標(biāo)儀由BioTek公司生產(chǎn)，CytoFLEX S流式細(xì)胞儀由Beckman Coulter生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將H9c2心肌細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)90%匯合率時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3.2 PAR2 siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞[7]：(1)細(xì)胞分組，將對(duì)數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞以每孔3×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每孔加入不含抗生素的培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時(shí)將細(xì)胞分為非特異性干擾組(NS組)和特異性干擾組(SI組)。(2)轉(zhuǎn)染，先將125 μL無血清培養(yǎng)基分別與脂質(zhì)體3 000(7.5 μL)和相應(yīng)的siRNA(5 μL) 各自混勻，再將兩種混合物混勻?yàn)橹|(zhì)體3000-非特異性siRNA和脂質(zhì)體3000-特異性siRNA復(fù)合物，將上述兩種復(fù)合物分別加入NS組和SI組細(xì)胞，再加入無血清培養(yǎng)基使每組的siRNA終濃度為50 nmol/L，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后重復(fù)上述傳染步驟再次向細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA。(3)第2次轉(zhuǎn)染完成后48 h收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測PAR2 mRNA表達(dá)情況：收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，采用TRIzol提取法抽提細(xì)胞的RNA，取純化的總RNA 2 μg，應(yīng)用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用實(shí)時(shí)定量 PCR檢測靶基因表達(dá),實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)FastStart SYBR-Green/Rox試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系：SYBR Green Ⅰ MasterMix 10×3 μL，100 μmol/L的上下游引物各0.6×3 μL，dd H2O 6.8×3 μL，cDNA 2×3 μL。將其混勻后以3復(fù)孔模式加入96孔PCR板。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 10 s;變性60℃ 30 s,退火延伸72℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。以標(biāo)本自身的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參。基因的引物序列見表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。運(yùn)用7500 Software v2.0.5軟件輸出數(shù)據(jù)。采用2-△△Ct分析法,計(jì)算SI組PAR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.3.4 H9c2心肌細(xì)胞H/R實(shí)驗(yàn)：siRNA轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞48 h后，更換無糖無血清培養(yǎng)基，將培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)小室，通入體積分?jǐn)?shù)950 mL/L的氮?dú)?體積分?jǐn)?shù)50 mL/L CO2混合氣體15 min，然后將缺氧培養(yǎng)小室置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱處理4 h后，取出缺氧處理的H9c2細(xì)胞，再更換含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱(95% O2+5% CO2)處理4 h[8]。

1.3.5 檢測LDH水平：H/R處理后，室溫下1 000 r/min離心5 min收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照LDH檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀440 nm處測量各管吸光度，檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH吸光度值，細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性(U/L)=(測定OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×1 000。

1.3.6 DCFH-DA熒光探針檢測H9c2心肌細(xì)胞活性氧含量：H/R處理后，收集兩組細(xì)胞，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1次，每個(gè)孔分別加入2 μmol/L的DCFH-DA 1 mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用事先預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，收集細(xì)胞置于冰上，立即流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測心肌細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量。

1.3.7 測定H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)SOD、丙二醛水平：H/R處理后，收集兩組H9c2心肌細(xì)胞，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞兩次，超聲破碎制備成10%勻漿，按照SOD、丙二醛檢測試劑盒說明，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力、硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H9c2心肌細(xì)胞PAR2敲除效率 CY3紅色熒光標(biāo)記的非特異性siRNA轉(zhuǎn)染NS組H9c2心肌細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞內(nèi)可見紅色熒光(見圖1)。轉(zhuǎn)染48 h后，NS組、SI組H9c2心肌細(xì)胞的PAR2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為0.99±0.10、0.28±0.02(t=12.383，P<0.001)。SI組H9c2心肌細(xì)胞的PAR2 mRNA下降至NS組的30%以下，證實(shí)有效敲除PAR2基因。

圖1 H9c2心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果(×100)

2.2 H/R后兩組觀察指標(biāo)比較 SI組的LDH含量、ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度、丙二醛含量均低于NS組(均P<0.05),SOD活力高于NS組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組觀察指標(biāo)比較(x±s)

3 討 論

研究表明，心肌IRI的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜,包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、心肌纖維能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及鈣超載等因素[9-10]。心肌IRI和H/R過程中可產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，破壞心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)[11]。作為氧化應(yīng)激通路中的重要分子，PAR2的激活可引起劑量依賴性的ROS產(chǎn)生增加，可以促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生發(fā)展[12]。PAR2的激活也可引起包括內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種類型細(xì)胞發(fā)生絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化[13-14]。另外，有研究表明H9c2心肌細(xì)胞H/R過程中釋放的ROS能夠觸發(fā)MAPK信號(hào)通路，提高細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)1/2、p38和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化水平[15]。Antoniak等[16]研究發(fā)現(xiàn)PAR2缺陷小鼠IRI后心肌組織ERK1/2、p38和JNK磷酸化減少。因此，我們推測PAR2敲低對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制可能與MAPK通路依賴的抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)。

大多數(shù)研究結(jié)果顯示外源性PAR2激動(dòng)劑可保護(hù)心肌免受IRI。其中，Napoli等[5]在小鼠活體心肌IRI模型中首次發(fā)現(xiàn)外源性選擇性激動(dòng)劑活化PAR2后可劑量依賴性減少IRI心肌中ROS的產(chǎn)生，提高相關(guān)抗氧化劑的活性，減輕缺血心肌的過氧化損傷，在IRI心肌中發(fā)揮保護(hù)作用。Antoniak等[16]在活體小鼠心肌IRI模型中研究發(fā)現(xiàn)PAR2缺陷可以減輕IRI心肌的炎癥反應(yīng)、心肌梗死和心肌重塑，然而，PAR2缺陷對(duì)心肌氧化應(yīng)激的影響尚未完全明確。從胚胎大鼠心肌獲取的H9c2細(xì)胞系和原代乳鼠心肌細(xì)胞非常相似，可傳代，易培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定，常用于心血管領(lǐng)域基礎(chǔ)方面的研究[17]。因此，我們以H9c2心肌細(xì)胞構(gòu)建體外H/R模型模擬在體心肌缺血再灌注，在細(xì)胞水平進(jìn)一步探索PAR2敲低對(duì)H/R損傷后心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。

LDH釋放是心肌細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。心肌細(xì)胞膜受損后，LDH即被釋放到細(xì)胞外，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平，可判斷心肌細(xì)胞的損傷程度；SOD能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞，間接反映機(jī)體清除自由基的能力；丙二醛為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，間接反映機(jī)體受自由基攻擊的程度。本研究結(jié)果顯示，H/R后，與NS組比較，SI組H9c2心肌細(xì)胞的ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度、丙二醛及LDH含量降低，SOD活力升高(均P<0.05)，表明PAR2敲低可減輕心肌細(xì)胞 H/R過程中氧化應(yīng)激損傷，但這與Napoli等[5]的研究結(jié)果恰恰相反。

在野生型小鼠中，為何PAR2激活和敲除都能改善心肌IRI，對(duì)于PAR2作用的矛盾結(jié)果，我們推測可能有以下原因：(1)細(xì)胞作用特異性。在小鼠心肌IRI模型中，PAR2對(duì)心肌組織不同細(xì)胞具有不同作用，因此外源性PAR2激動(dòng)劑可能通過活化血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的PAR2，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管而發(fā)揮保護(hù)作用，但無法作用于炎癥細(xì)胞和心肌細(xì)胞表達(dá)的PAR2；而PAR2敲除導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞均缺乏PAR2，可能通過抑制全身的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激過程減輕心肌IRI。(2)外源性PAR2激動(dòng)劑的心肌保護(hù)作用可能與偏置信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，Hollenberg等[18]發(fā)現(xiàn)合成的外源性配體和胰蛋白酶裂解的自身配體可結(jié)合PAR2的不同結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，能夠激活不同信號(hào)通路，導(dǎo)致不同細(xì)胞效應(yīng)。(3)外源性PAR2激動(dòng)劑引起β抑制蛋白激活[19]，研究表明β抑制蛋白可阻止核轉(zhuǎn)錄因子κB的激活和靶向基因的轉(zhuǎn)錄，減輕心肌組織局部炎癥反應(yīng)[20]。此外，β抑制蛋白能夠反激活表皮生長因子受體而發(fā)揮保護(hù)心肌作用[21]，而PAR2整體缺陷細(xì)胞無法作用于β抑制蛋白。

綜上所述，在H/R中敲低PAR2基因可通過減輕氧化應(yīng)激損傷從而保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞，這可為PAR2在心肌IRI的防治作用提供了參考依據(jù)。鑒于PAR2在心肌IRI中的研究尚存在缺陷，有必要進(jìn)一步明確PAR2在心肌IRI中的確切作用，分析其具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑和分子機(jī)制。整體敲低人類心肌細(xì)胞PAR2是不現(xiàn)實(shí)的，因此研制選擇性和特異的PAR2拮抗劑或PAR2阻斷抗體仍可能是緩解心肌IRI的治療目標(biāo)。