張金蒙，許秋澗，陳洋，蔡敏，文念念，張少虎，曾志剛

(湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院，湖北 咸寧 437100)(湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院，湖北 咸寧 437100 湖北省香花植物工程技術(shù)研究中心，湖北 咸寧 437100)

天然產(chǎn)物是新農(nóng)藥創(chuàng)制的重要資源，從天然產(chǎn)物中篩選先導(dǎo)化合物及以天然產(chǎn)物為探針發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)是天然產(chǎn)物研究的重點(diǎn)領(lǐng)域，是利用天然產(chǎn)物創(chuàng)制新農(nóng)藥的主要途徑[1]。枸骨(Ilexcornuta)為冬青科冬青屬藥用植物，資源豐富，主要分布于我國長江中下游地區(qū)。枸骨提取物化學(xué)成分豐富，藥理活性多樣，具有較高的研究價(jià)值。

枸骨的根、枝、葉和果都可用于制藥[2,3]。枸骨葉具有多種藥理活性，如清熱養(yǎng)陰、平肝益腎等[3]，亦可作為避孕和心血管疾病藥物以及抗菌劑[4]。枸骨根有祛風(fēng)止痛的功效，用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、腰肌勞損、頭痛、牙痛以及黃疸型肝炎等病癥，是一種具有重要藥用價(jià)值的中藥材[5]。近年來研究表明，枸骨莖葉主要成分為三萜及三萜皂苷、黃酮及其苷類、木質(zhì)素類及脂肪酸類化合物[3～7]。這些化合物具有治療喉嚨痛、減肥、緩解高血壓、抗氧化、抗糖尿病及抑制細(xì)菌等作用[4,8～12]。

枸骨提取物的農(nóng)藥活性研究相對較少且主要集中在其內(nèi)生菌方面。陳列忠等[13]、石一珺等[14]和申屠旭萍等[15]報(bào)道了枸骨內(nèi)生真菌哈茨木霉(Trichodermaharzianum)及其產(chǎn)生的抗真菌活性的次級代謝產(chǎn)物Trichodermin。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，哈茨木霉菌對黃瓜立枯病菌存在競爭和寄生作用，Trichodermin對蕃茄早疫病、黃瓜立枯病以及番茄灰霉病有較好的預(yù)防作用和治療作用。劉敏[16]、郭也等[17]報(bào)道了從枸骨葉中分離的內(nèi)生真菌IFB-GLP-4，該真菌具有抗芽孢桿菌活性且能產(chǎn)生新骨架化合物。趙龍飛等[18]研究了從枸骨健康植株的根、莖、葉及果實(shí)中分離得到的85種內(nèi)生細(xì)菌的活性，結(jié)果表明部分菌株對煙草赤星病菌、稻瘟病菌、棉花枯萎病菌等植物病害具有較好的抑制作用。目前關(guān)于枸骨提取物醫(yī)藥活性的研究比較突出，而農(nóng)藥活性方面的報(bào)道則較為少見。為初步明確枸骨的農(nóng)藥活性，本研究探討了枸骨莖葉甲醇粗提物對部分植物真菌病害的抑制作用，以期為枸骨的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

枸骨莖葉采摘于湖北科技學(xué)院溫泉校區(qū)附近，置于鼓風(fēng)干燥箱在40℃下烘干，微型粉碎機(jī)粉碎過60目篩，得枸骨莖葉粉末。

供試菌種有水稻稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriadothidea)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，均來源于湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，無菌水1000mL。

1.2 儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備有MP2002電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)、SPX-280生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)、WD900G微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司)、DHG90A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海索普儀器有限公司)、SW-CJ-2FD雙人超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)等。

1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 粗提物的制備

首先，將粉碎后的約1.5kg枸骨莖葉粉末倒入2.5L棕色試劑瓶中，用甲醇浸泡7d，期間每隔1～2d進(jìn)行振蕩搖勻。然后，將該甲醇浸提液過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮、真空干燥后，得到約30g黑色膏狀物。所得膏狀物密封后置于冰箱保鮮層(4℃)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 粗提物抑菌活性測定

采用菌絲生長速率法[19]測定粗提物對供試菌種的抑制作用。首先，將粗提物用70%乙醇溶解，無菌水溶液稀釋至100mg/mL。然后，吸取2mL上述藥液，與18mL冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基充分混勻，倒入平板，即得含10mg/mL粗提物的培養(yǎng)基?？瞻讓φ諡樘砑酉嗤康臒o菌水。

用打孔器(d=0.5cm)取靶標(biāo)病菌，將所得菌餅移至前述含藥平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)，同一處理重復(fù)3次。當(dāng)對照平板上菌落布滿至培養(yǎng)皿2/3左右時(shí)，采用十字交叉法測量并記錄菌落直徑。菌絲生長抑制率計(jì)算公式如下：

式中：DCK為空白對照菌落直徑;Dt為處理組菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸骨莖葉粗提物的抑菌活性

生物活性測試結(jié)果表明，10mg/mL的枸骨莖葉粗提物對水稻稻瘟病、小麥赤霉病、蘋果輪紋病、芒果炭疽病以及香蕉枯萎病等植物真菌病害表現(xiàn)出一定的抑制作用(見表1和圖1)。其中，粗提物在該濃度下對水稻稻瘟病和小麥赤霉病的抑制活性較好，抑制率分別為100.00%，89.86%。這說明粗提物在防治相關(guān)植物真菌病害方面具有潛在的利用價(jià)值。

表1 10mg/mL的枸骨莖葉粗提物對供試菌種的抑制作用

注：a1～a5分別為菌株A～E處理菌落；b1～b5分別為相應(yīng)對照。圖1 粗提物對5種病原真菌的抑制效果

2.2 枸骨莖葉粗提物對病菌的毒力效果

鑒于粗提物對水稻稻瘟病和小麥赤霉病表現(xiàn)出良好的抑制作用，進(jìn)一步研究了粗提物在濃度分別為2、4、6、8mg/mL下對上述2種病原菌菌絲生長的影響(表2、圖2及圖3)，以明確其毒力效果。從表2可以看出，枸骨莖葉甲醇提取物在測試濃度下對水稻稻瘟病菌和小麥赤霉病菌均具有一定的抑制活性，不同濃度之間抑制活性差異較為顯著且隨提取物濃度的增大而增強(qiáng)。

粗提物對靶標(biāo)菌的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)及其毒力回歸方程通過SPSS 22.0軟件計(jì)算求得。其中，粗提物對水稻稻瘟病菌的毒力回歸方程為y=0.1058x-0.0615，相關(guān)系數(shù)R2為0.9842，EC50為4.616mg/mL。對小麥赤霉病菌的毒力回歸方程為y=0.063x+0.2507，相關(guān)系數(shù)R2為0.9664，EC50為3.425mg/mL。毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.9，表明粗提物的濃度和抑菌效果呈正相關(guān)，即粗提物的濃度越高，抑菌效果越好。由此可以看出，枸骨莖葉甲醇提取物對小麥赤霉病菌和水稻稻瘟病菌防效較好，對挖掘天然源綠色殺菌分子具有一定的參考意義。

表2 不同濃度枸骨莖葉粗提物對水稻稻瘟病菌和小麥赤霉病菌的抑制作用

注：a、b、c、d、e、f分別代表0、2、4、6、8、10mg/mL粗提物圖2 不同濃度粗提物對水稻稻瘟病菌的活性

注：a、b、c、d、e、f分別代表0、2、4、6、8、10mg/mL粗提物圖3 不同濃度下粗提物對小麥赤霉病菌的活性

3 結(jié)語

植物性農(nóng)藥生物活性多樣，作用方式復(fù)雜，具高效、低毒、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[20]。從植物中尋找具有農(nóng)藥活性的物質(zhì)，發(fā)掘先導(dǎo)化合物，開發(fā)綠色農(nóng)藥，是新農(nóng)藥創(chuàng)制的重要途徑。枸骨是一種具有較高藥用價(jià)值的植物，是天然產(chǎn)物研究中的熱點(diǎn)。目前關(guān)于枸骨化學(xué)成分及其醫(yī)藥用途的研究較多，而鮮見有關(guān)于其農(nóng)藥活性方面的報(bào)道。本研究結(jié)果表明，枸骨莖葉提取物對水稻稻瘟病菌和小麥赤霉病菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性。這說明在該提取物中存在一類或幾類可抑制相關(guān)農(nóng)業(yè)真菌病害的物質(zhì)，提示其可能在農(nóng)用殺菌劑方面具有一定的開發(fā)潛力。因此，厘清枸骨提取物中具體的農(nóng)藥活性成分和及其作用機(jī)理，將有助于綠色防控植物真菌病害和發(fā)掘生態(tài)環(huán)境友好型農(nóng)藥分子。