唐 毅，吳榮華，袁 淵，孫龍龍，唐紅霞，安小平，沈財(cái)祥

(1.淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715；2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，重慶 400715；3.重慶多普泰制藥股份有限公司，重慶400800；4.重慶銘實(shí)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，重慶400800；5.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，300384)

寬體金線蛭(Whitmaniapigra)俗稱螞蟥，屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)蛭綱顎蛭目水蛭科。寬體金線蛭在陸地淡水環(huán)境生長(zhǎng)繁殖,主要分布于我國(guó)南方地區(qū)的淡水水域中，在北方部分地區(qū)也有少量存在。寬體金線蛭主要應(yīng)用于醫(yī)藥上，是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外緊俏的醫(yī)用價(jià)值較高的名貴中藥材，既可供中藥處方配伍使用，也是許多制藥廠生產(chǎn)的多種中成藥(丸劑和膠囊等)中的重要成分[1]。據(jù)有關(guān)研究結(jié)果顯示，寬體金線蛭的干體和鮮體均含有高抗凝活性物質(zhì)，具有顯著的抗凝活性[2]。主要用于防治心腦血管疾病，并具有較好的抗癌和保健功能。隨著醫(yī)藥行業(yè)對(duì)寬體金線蛭需求量的逐年增多，受利益驅(qū)動(dòng)，人們過(guò)度捕捉野生資源現(xiàn)象嚴(yán)重，從而導(dǎo)致自然資源量嚴(yán)重下降，甚至枯竭，因而其價(jià)格也隨之成倍增長(zhǎng)。基于此，近幾年來(lái)，寬體金線蛭人工集約化養(yǎng)殖發(fā)展較為迅速，隨之而來(lái)的有關(guān)病害也在逐年增多[3]，人們采用多種藥物對(duì)病害進(jìn)行防治，但因?qū)λ幬锏姆N類選擇或用法用量不當(dāng)，甚至濫用等，導(dǎo)致寬體金線蛭大量死亡。為了更好地了解寬體金線蛭對(duì)常用漁藥的敏感性，實(shí)驗(yàn)選擇二氧化氯、高錳酸鉀、苯扎溴銨、戊二醛、伊維菌素和聚維酮碘作為研究對(duì)象，進(jìn)行寬體金線蛭幼蛭的急性毒性試驗(yàn)，以期探討對(duì)寬體金線蛭的用藥劑量，為寬體金線蛭的自然保護(hù)和疾病防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)水蛭

試驗(yàn)水蛭來(lái)自重慶銘實(shí)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司水蛭養(yǎng)殖基地人工繁殖培育的寬體金線蛭幼蛭。隨機(jī)選取規(guī)格相近，無(wú)病無(wú)傷、體質(zhì)健壯的個(gè)體(平均體質(zhì)量為(0.11±0.05)g/條)作為試驗(yàn)對(duì)象。試驗(yàn)前將寬體金線蛭置于塑料箱中暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)期間，每天換新水量占總水體的10%左右。

1.2 試驗(yàn)條件

試驗(yàn)在西南大學(xué)水產(chǎn)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)所用容器為50 L的長(zhǎng)方形塑料箱，箱內(nèi)放置用于防止水蛭外逃的篩絹網(wǎng)袋，并加入10 L經(jīng)曝氣24 h以上的自來(lái)水作為試驗(yàn)用水，其pH為6.5～7.0，溶解氧7.0～8.5 mg/L，水溫26.5～28.5 ℃。為減少光照對(duì)水蛭的影響，試驗(yàn)在室內(nèi)弱光條件下進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)藥品

二氧化氯：含40 %穩(wěn)定性白色粉末二氧化氯(山西運(yùn)城益康藥業(yè)有限公司)；苯扎溴銨：含1.1%苯扎溴銨，淺黃色液體(山西運(yùn)城益康藥業(yè)有限公司)；聚維酮碘：含10 %聚維酮碘(運(yùn)城春蕾藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，紅棕色晶狀粉末；高錳酸鉀：分析純，含99.9 %高錳酸鉀(成都市科龍化工試劑廠)，紅褐色晶體；伊維菌素：含0.4 %伊維菌素(成都市科龍化工試劑廠)，白色晶狀粉末；戊二醛：含50 %戊二醛(成都市科龍化工試劑廠)，無(wú)色透明油狀液體。

1.4 試驗(yàn)方法

采用靜水生物毒性試驗(yàn)法進(jìn)行試驗(yàn)[4-5]。為排除殘餌糞便對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,試驗(yàn)期間不投餌，每天測(cè)定水溫。試驗(yàn)分為預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)以取得24 h使水蛭全致死的最低質(zhì)量濃度值及96 h無(wú)死亡的最高質(zhì)量濃度值，并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定出各試驗(yàn)藥物濃度區(qū)間，然后按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置5個(gè)濃度梯度組(表1)和1個(gè)空白組，每組設(shè)2個(gè)平行，每個(gè)平行隨機(jī)放15條水蛭。試驗(yàn)前先用蒸餾水將試驗(yàn)藥物配成母液，再根據(jù)各試驗(yàn)濃度梯度組的質(zhì)量濃度吸取母液加入試驗(yàn)容器中，配成所需濃度的試驗(yàn)藥液，藥液現(xiàn)配現(xiàn)用。對(duì)具有較大揮發(fā)性的二氧化氯藥物，在試驗(yàn)開(kāi)始后每隔24 h更換1次試驗(yàn)液，以保證試驗(yàn)藥物的濃度及藥效，其余5種藥品均不更換。藥液配好后，將裝有15條水蛭的篩絹網(wǎng)袋，放入試驗(yàn)箱并使其淹沒(méi)試驗(yàn)液中。試驗(yàn)開(kāi)始后連續(xù)8 h觀察并記錄水蛭的活動(dòng)狀況、中毒癥狀、死亡情況等，之后每8 h觀測(cè)一次,并記錄各質(zhì)量濃度組水蛭24、48、72、96 h的死亡數(shù)和存活數(shù)，對(duì)死亡的水蛭及時(shí)撈除，放入曝氣24 h的清水中。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為水蛭卷曲、蛭體僵硬，5 min內(nèi)多次針刺無(wú)任何反應(yīng)則判定為死亡。

表1 試驗(yàn)藥物及其濃度

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用改良寇氏法( Karber)計(jì)算半致死濃度(LC50)[6]，依據(jù) Turubell公式計(jì)算安全濃度(SC)[7-8]。

2 結(jié)果

6種漁藥對(duì)寬體金線蛭幼體急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6種常用漁藥對(duì)寬體金線蛭幼體急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)6種漁藥對(duì)寬體金線蛭幼蛭的急性毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明(表2)，當(dāng)二氧化氯濃度最低(5.600 mg/L)時(shí)，30 h后水蛭出現(xiàn)明顯中毒癥狀，身體變軟，反應(yīng)遲鈍，40 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)15%左右；濃度為最高(13.44 mg/L)時(shí)，2 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，72 h死亡率達(dá)到100%。當(dāng)高錳酸鉀濃度最低(1.6 mg/L)時(shí)，50 h后水蛭出現(xiàn)身體變形和亂晃癥狀，82 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，死亡水蛭體表黏液增多，吸盤(pán)變白變腫，96 h死亡率約7%；濃度為最高(5.000 mg/L)時(shí)，4 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)到100 %。當(dāng)苯扎溴銨濃度最低(0.001 mg/L)時(shí)，58 h后水蛭身體中后部出現(xiàn)較明顯腫脹，96 h內(nèi)未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；濃度為最高(0.010 mg/L)時(shí)，4h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，72 h死亡率達(dá)到100%。當(dāng)戊二醛濃度最低(0.036 mg/L)時(shí)，42 h后水蛭出現(xiàn)吸盤(pán)腫脹、活力減弱癥狀，56 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)7%左右；濃度為最高(0.120 mg/L)時(shí)，10 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)到70%左右。當(dāng)伊維菌素濃度為最低(0.002 mg/L)時(shí)，90 h后水蛭出現(xiàn)身體變形、蜷縮癥狀，96 h內(nèi)未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；濃度為最高(0.020 mg/L)時(shí)，9 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)到90%左右。當(dāng)聚維酮碘濃度為最低(1.800 mg/L)時(shí)，42 h后水蛭出現(xiàn)身體變形、蜷縮癥狀，68 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，死亡水蛭體表黏液增多，96 h死亡率為5%左右；濃度為最高(5.600 mg/L)時(shí)，8 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，96 h死亡率達(dá)到100%。6種漁藥對(duì)寬體金線蛭的96 h半致死濃度最低者為伊維菌素(0.001 6 mg/L)，最高者為二氧化氯(8.627 8 mg/L)。安全質(zhì)量濃度(LC)最高者為二氧化氯(1.559 3 mg/L)，最低者為伊維菌素(0.000 2mg/L)，其從大到小依次為：二氧化氯﹥聚維酮碘﹥高錳酸鉀﹥戊二醛﹥苯扎溴銨﹥伊維菌素。

3 討論

6種藥物對(duì)寬體金線蛭急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，寬體金線蛭在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)的死亡率和對(duì)藥物的半致死濃度隨藥液濃度大小與作用時(shí)間長(zhǎng)短的不同，即藥物濃度的大小和作用時(shí)間的長(zhǎng)短影響受試生物的死亡率及存活情況。由表2可知，二氧化氯等6種藥物對(duì)寬體金線蛭幼蛭的半致死濃度(LC50)值隨試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，表明該6種藥物對(duì)寬體金線蛭的毒性作用隨時(shí)間的增加而增強(qiáng)，因此藥物的毒性具有累加效應(yīng)。

在24～72 h內(nèi)，二氧化氯對(duì)寬體金線蛭的半致死濃度(LC50)值由17.972 1 mg/L降低到8.924 8 mg/L，即隨試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)LC50存在著顯著變化；在72～96 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)半致死濃度(LC50)值(8.9248～8.6278 mg/L)則沒(méi)有明顯變化。結(jié)果表明,在24～48 h內(nèi)寬體金線蛭對(duì)二氧化氯藥物具有一定的抗藥性，但當(dāng)試驗(yàn)時(shí)間從48 h增加到72 h時(shí)抗藥性則逐漸降低。

高錳酸鉀、聚維酮碘、戊二醛、苯扎溴銨、伊維菌素等5種藥在24～48 h內(nèi)，對(duì)寬體金線蛭的半致死濃度(LC50)值隨試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)存在著顯著變化；但當(dāng)試驗(yàn)時(shí)間從48 h增加到96 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)半致死濃度(LC50)值則沒(méi)有明顯的變化，表明在48 h之前寬體金線蛭對(duì)以上藥物具有一定的抗藥性，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抗藥性則逐漸減弱。

各試驗(yàn)時(shí)間段半致死濃度(LC50)值由高至低依次為：二氧化氯>聚維酮碘>高錳酸鉀>戊二醛>苯扎溴銨>伊維菌素。6種藥物對(duì)寬體金線蛭的96 h LC50分別為8.627 8、3.453 8、2.813 8、0.072 9、0.003 2、0.001 6 mg/L，屬于一般毒性至高毒性藥物；安全濃度(SC)分別為1.559 3、0.676 9、0.478 1、0.006 8、0.000 3和0.000 2 mg/L。其中，高錳酸鉀對(duì)寬體金線蛭的安全濃度與對(duì)菲牛蛭的安全濃度(0.54 mg/L)相近[9]。結(jié)果表明,6種漁藥對(duì)寬體金線蛭的毒性強(qiáng)弱依次為,伊維菌素>苯扎溴銨>戊二醛>高錳酸鉀>聚維酮碘>二氧化氯。

4 結(jié)論

(1)二氧化氯對(duì)寬體金線蛭的96 h LC50為8.627 8 mg/L，安全濃度(SC)為1.559 3 mg/L，安全性較高，在其養(yǎng)殖過(guò)程中可安全使用。

(2)高錳酸鉀對(duì)寬體金線蛭的96 h LC50為2.813 8 mg/L，安全濃度(SC)為 0.478 1 mg/L，安全性較低，在其養(yǎng)殖過(guò)程中需慎用。

(3)聚維酮碘對(duì)寬體金線蛭的96 h LC50為3.453 8 mg/L，安全濃度(SC)為0.676 9 mg/L，安全性較高，在其養(yǎng)殖過(guò)程中可安全使用。

(4)戊二醛對(duì)寬體金線蛭幼蛭的96 h LC50為0.072 9 mg/L，安全濃度(SC)為0.006 8 mg/L，為高毒藥物，因此在其疾病防治中應(yīng)慎用。

(5)苯扎溴銨對(duì)寬體金線蛭幼蛭的96 h LC50為0.003 2 mg/L，安全濃度(SC)為0.000 3 mg/L，為高毒藥物，在其疾病防治中應(yīng)慎用。

(6)伊維菌素對(duì)寬體金線蛭幼蛭的96 h LC50為0.001 6 mg/L，安全濃度(SC)為0.000 2 mg/L，為高毒藥物，在其疾病防治中應(yīng)慎用。